[发明专利]一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离培养及传代方法

权利要求书

1.一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离方法，包括了以下步骤：

1)取当天新生儿15-20cm长的新鲜脐带，放入无菌含双抗的PBS溶液中4℃储存。

2)用一个钝头的针头扎入脐带静脉管中，用无菌含双抗的PBS溶液冲洗至流出液体中无可见血液。

3)夹住脐带下端，加入15ml的胶原酶I型(1mg/ml)37℃水浴消化10-15分钟。

4)消化完后，将下端手术钳松开，消化液流入一个50ml无菌离心管中，用无菌含双抗PBS溶液冲洗脐带2-3次。

5)将收集液离心(2000转/分)5分钟。

6)倒去上清，加入10ml M199培养基(含酚红、20％新生小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、100μg/ml血管内皮细胞生长因子-肝素)，用弯管吹散细胞，将所有液体转入一个用明胶包被好的培养瓶中，于CO₂培养箱在37℃培养。

2.根据权利要求1所述一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离方法，其特征在于：所用脐带为当天新生儿15-20cm长的新鲜脐带，用无菌含双抗的PBS溶液4℃储存。

3.根据权利要求1所述一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离方法，其特征在于：加入15ml的胶原酶I型(1mg/ml)于37℃水浴消化10-15分钟。

4.根据权利要求1所述一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的分离方法，其特征在于：所用培养基为10ml M199培养基(含酚红、20％新生小牛血清、2mmol/L L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、100μg/ml血管内皮细胞生长因子-肝素)，转入一个用明胶包被好的培养瓶中，于CO₂培养箱在37℃培养。

5.一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的培养与传代方法，包括了以下步骤：

1)HUVEC细胞在CO₂培养箱37℃培养24小时后，倒掉培养基，并用无菌含双抗的PBS溶液清洗2-3次，洗掉红细胞和死细胞，加入10ml新鲜的M199培养基。

2)以后每2天换一次培养基，一般培养5-7天，细胞可长满至80-90％单层，正常的内皮细胞长满后如同卵石状，这时可以传代。

3)倒掉培养基，用无菌的PBS溶液清洗2-3次，加入2-3ml消化液(0.25％胰酶+0.1％EDTA)消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

4)用弯管将细胞吹打下来，并将所消化的细胞转移到一个50ml无菌离心管中，2000转/分，离心5分钟

5)倒掉上清，加入20ml新鲜培基，一般一瓶细胞可传代2-3瓶。选择传代2-3代的HUVEC(培养了20天左右)用于实验。

6.根据权利要求5所述一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的培养与传代方法，其特征在于：HUVEC细胞于CO₂培养箱在37℃培养24小时后，用无菌双抗PBS溶液清洗2-3次后加入10ml新鲜的M199培养基。

7.根据权利要求5所述一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的培养与传代方法，其特征在于：每2天换一次培养基，一般培养5-7天，至细胞长满至80-90％单层，进行传代。

8.根据权利要求5所述一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的培养与传代方法，其特征在于：用2-3ml消化液(0.25％胰酶+0.1％EDTA)消化细胞，在显微镜下观察，一旦细胞变圆，即加入2-3倍的有血清的DMEM培养基终止反应。

9.根据权利要求5所述一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的培养与传代方法，其特征在于：消化的细胞2000转/分，离心5分钟。

10.根据权利要求5所述一种人脐静脉内皮细胞HUVEC的培养与传代方法，其特征在于：选择传代2-3代的HUVEC(培养了20天左右)用于实验。