[发明专利]一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域,涉及一个能通过RNA干扰途径特异降低细胞内Orai1基因表达量的发夹型小干扰RNA（Orai1 shRNA）的序列；以及利用这种发夹型小干扰RNA（shRNA）对Orai1基因进行特异性干扰后抑制细胞增殖和转移的作用，尤其是抑制肝癌细胞系（HepG2）增殖和转移的作用。

背景技术

肿瘤的增殖、侵袭、转移是一个复杂的过程，包括肿瘤细胞本身的自律性，及其与细胞外环境包括基质和细胞的相互作用。肿瘤细胞针对细胞外刺激产生的应答通过信号转导过程来调节，进而影响细胞的生命活动。许多信号转导通路都有一个共同的调节点：细胞内Ca²⁺调控。细胞内Ca²⁺的升高可以作为外界信号传递到细胞内的标志。大量实验表明Ca²⁺参与了细胞的增殖、侵袭、转移过程。在肿瘤细胞的运动、粘附过程中，都伴随有细胞内Ca²⁺的升高，因而调控细胞内Ca²⁺浓度的分子可能在肿瘤细胞的侵袭转移过程中发挥重要作用。

在各种不同的细胞中，受体调控细胞内钙库释放钙离子之后，都会随之引起细胞膜上钙离子的内流，这种现象被称为钙离子释放激活钙内流(CRAC)。钙离子释放激活钙内流(CRAC)通道是位于非兴奋性细胞质膜上的重要钙离子通道，是非兴奋性细胞(尤其淋巴细胞和肿瘤细胞)中胞外钙离子进入细胞内的主要途径，但是CRAC通道的分子机制目前还不清楚。

Orai1是一个新近发现的基因，是组成CRAC通道至关重要的亚单位。Orai1是位于细胞质膜上的，由4个跨膜片段构成的跨膜蛋白，其N端和C端都位于细胞内。其第1个和第3个跨膜片段上存在钙离子结合位点，靠近N端的区域是脯氨酸富集区，具有跨膜转移钙离子的能力，因此其他离子很难从该通道进入细胞，决定了由Orai1蛋白组成的CRAC通道具有钙离子选择性。内质网中充满Ca²⁺时，Orail蛋白以单体形式游离在细胞质膜上，CRAC通道处于关闭状态。当细胞受到外界刺激时，细胞质中IP3浓度升高，引起细胞内Ca²⁺浓度轻微升高，质膜上的Orail蛋白自发的组装成四聚体，从而激活CRAC通道，使得胞外Ca²⁺进入细胞内。最近的研究结果表明，Orai1在促进肿瘤细胞增殖和黏附侵袭的过程中发挥重要作用。因此，抑制Orai1基因的转录和表达可能是抑制肿瘤细胞增殖和转移的有效方法。

shRNA（short hairpin RNA）是“短发夹RNA”，shRNA包括两个短反向重复序列，中间由一茎环（loop）序列分隔的，组成发夹结构，由pol Ⅲ启动子控制。随后再连上5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。利用shRNA干涉基因可以克服siRNA作用时间短暂的缺点，是一种稳定沉默基因的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA及其应用，该shRNA可以特异性抑制人Orai1基因表达。

本发明的技术解决方案是：一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其碱基序列如SEQ IDNo.1所示，即：

5’-CACCGCUCACUGGUUAGCCAUAAGAUUCAAGAGAUCUUAUGGCUAACCAGUGAGCUUUUUUG-3’。

一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，其针对的靶序列如SEQ IDNo.2所示，即GCUCACUGGUUAGCCAUAAGA。

一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，该shRNA通过如SEQ IDNo.3或4所示的DNA寡核苷酸链转录生成，即

5’-CACCGCTCACTGGTTAGCCATAAGATTCAAGAGATCTTATGGCTAACCAGTGAGCTTTTTTG-3’，或

5’-GATCCAAAAAAGCTCACTGGTTAGCCATAAGATCTCTTGAATCTTATGGCTAACCAGTGAGC-3’。

一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，该shRNA通过包含如SEQ IDNo.3或4所示的DNA寡核苷酸链的质粒转录生成。

一种针对Orai1基因、抑制肿瘤增殖和转移的shRNA，该shRNA在制备抑制肿瘤细胞增殖和转移的药物中的应用。