[发明专利]一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种分析厌氧氨氧化菌群的方法。

背景技术

厌氧氨氧化菌(ANAMMOX)是最新发现的浮霉菌门(Planctomycetes)的一员，属于严格厌氧自养菌，它能以氨氮(NH₄⁺)为电子供体，亚硝氮(NO₂^-)为电子受体，将氨氮(NH₄⁺)和亚硝氮(NO₂^-)直接转变成氮气(N₂)。厌氧氨氧化菌的发现，对于研究地球氮循环、丰富微生物理论以及开发新型生物脱氮工艺均具有巨大的推动作用。目前，已证明厌氧氨氧化菌广泛分布于海洋、湖泊、河流底泥、地下水以及许多污水处理装置中，并在地球氮循环中起着举足轻重的作用，据报道，其氮气产量占海洋氮气产量的30％-50％^[2，3]。许多水处理专家将其应用到污水脱氮工艺中，解决了传统硝化-反硝化工艺中的不足，有着良好的推广应用前景。

按照《伯杰氏系统细菌学手册》第2版的细菌分类方法，厌氧氨氧化菌被确定为浮霉菌门(Planctomycetes)的一员。目前，已经发现的厌氧氨氧化菌有五个属，分别是CandidatusKuenenia、CandidatusBrocadia、CandidatusAnammoxoglobus、CandidatusJettenia、CandidatusScalindua。

在对环境样品中厌氧氨氧化菌的群落组成分析时，人们常常通过克隆、测序构建16SrDNA克隆文库的方法。虽然这种方法避免了对厌氧氨氧化菌纯培养的要求，但是构建克隆文库工作量大，费用高，不能实现厌氧氨氧化菌的快速分析。

发明内容

本发明是要解决现有的分析厌氧氨氧化菌群的方法工作量大，费用高，不能实现厌氧氨氧化菌的快速分析的问题，提供一种快速分析厌氧氨氧化菌群的方法。

本发明快速分析厌氧氨氧化菌群的方法，按以下步骤进行：

一、使用试剂盒提取待分析样品的DNA；

二、特异性PCR扩增：以样品的DNA为模板，以Pla46F和630R为引物，进行第一次PCR扩增，获得扩增产物A，将扩增产物A经DNA纯化试剂盒纯化，获得纯化产物，然后以纯化产物为模板，以AMX368F和AMX820R为引物，进行第二次PCR扩增，获得扩增产物B；

三、限制性内切酶酶切：将扩增产物B经1U的绿豆核酸酶消化30min，消化后的扩增产物B采用PCR产物纯化试剂盒纯化，然后使用MspI和RsaI对纯化的扩增产物B进行双酶切，获得酶切产物；

四、酶切产物纯化：向酶切产物中加入1μL 3mol/L、pH为5.2的NaAc溶液和20μL-20℃、体积浓度为96％的乙醇溶液，然后于10000rpm离心，弃上清，向沉淀中加入体积浓度为70％的乙醇溶液清洗，然后于10000rpm离心，取沉淀，干燥后加入5μL灭菌超纯水溶解沉淀；

五、毛细管电泳：将1μL步骤四中溶解的沉淀、9μL甲酰胺和0.25μL DNA分子量内标-500混匀后，用DNA测序仪进行毛细管电泳，电泳程序：①变性，90℃，120sec；②进样，2.0kV，30sec；③分离，5.0kV，60℃，60min，电泳结果即为酶切后末端片段的长度；

六、毛细管电泳结果分析：依据下述对应关系，

将DNA测序仪获得的电泳结果数据采用GeneMapper 4.0进行分析，即获得厌氧氨氧化菌群分析结果；其中步骤二中引物Pla46F为5’-GGATTAGGCATGCAAGTC-3’，引物630R为5’-CAKAAAGGAGGTGATCC-3’，引物AMX368F为5’-TTCGCAATGCCCGAAAGG-3’，引物AMX820R为5’-AAAACCCCTCTACTTAGTGCCC-3’。

本发明通过模拟PCR和模拟酶切，以美国国家生物技术信息中心(NCBI)的数据库为对象，得出了不同厌氧氨氧化菌属所对应的理论末端片段长度。本发明方法无需克隆、测序，直接通过对酶切后末端片段长度(T-RFs)的分析，即可完成对样品中厌氧氨氧化菌群的快速分析，减小了工作量，降低了成本。

本发明的优点在于：

(1)本发明避免了通过克隆，测序建立16S rRNA基因克隆文库来分析厌氧氨氧化菌群结构的繁琐步骤，实现了厌氧氨氧化菌群组成的快速分析。