[发明专利]基因突变型重组蛋白酶K及其工业化生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因突变型重组蛋白酶K及其工业化生产方法。更具体而言，本发明涉及一种经过基因改造和蛋白质工程化得到的酶活性为同种天然蛋白酶活性2倍以上的基因突变型重组蛋白酶K；以及利用酵母细胞大规模培养表达外源蛋白，制备所述基因突变型重组蛋白酶K的工业化生产方法和工艺过程。

背景技术

蛋白酶K是一种丝氨酸蛋白酶，于1974年首次在林伯氏白色念球菌（Tritirachium album limber）的提取物中发现（Ebeling W等，Eur J Biochem.1974 Aug 15;47(1):91-7）。由于该酶能够消化富含二硫键的天然角蛋白，林伯氏白色念球菌能够以角蛋白作为唯一的碳源/氮源生长，蛋白酶K也由此得名。

蛋白酶K最大的特点在于对天然蛋白质具有广谱高效的切割能力，是现有蛋白酶中活性最高的一种。该酶偏好于切割脂肪族氨基酸和芳香族氨基酸，特别是丙氨酸的羧基端肽键。

此外，蛋白酶K还是一种稳定性非常出色的酶，在pH 4~pH 12、20℃~60℃的条件下均有活性，在多种能够使蛋白质变性的化学试剂（如SDS、尿素、螯合剂（如EDTA）及巯基试剂（如胰蛋白酶抑制剂或糜蛋白酶抑制剂））中也具有切割蛋白质的能力。

由于细胞裂解过程中通常使用SDS溶液，而蛋白酶K在0.5%（w/v）的SDS溶液中依然能够维持完全的活性，使得其可应用于核酸提取中，通过快速降解细胞裂解释放出的胞内核酸酶，分离得到完整的核酸片段。在先研究还表明，蛋白酶K在去污剂（如Triton X-100）中也具有出色的稳定性，因而还被广泛用于膜蛋白及跨膜蛋白的研究中。

近年来，蛋白酶K的应用并不仅仅局限在医疗诊断及科研领域，在工业制革、造纸、饲料等领域中也可以替代传统的可能存在污染的化学方法处理原材料。因此，得到高活性、低造价的蛋白酶K具有实际意义。

然而，天然蛋白酶K依靠传统发酵提取，产量很低，成本较高，不适合今后该产品的大规模运用。因此，目前本领域的研究焦点集中在利用基因工程技术和蛋白质工程技术，改造蛋白质的分子结构，期望得到活性更高、成本更低的蛋白酶K。

迄今为止，现有工业化生产的基因重组蛋白酶K是以原核细胞为宿主，譬如大肠杆菌表达系统，其优点是简便、经济。然而，该系统表达得到的蛋白酶K活性不高或者没有活性，达不到天然蛋白酶K的水平，这可能是由于蛋白酶K需要转录或翻译后处理过程，原核系统无法实现这个功能。此外，利用原核细胞进行外源蛋白表达的产量过低，因而难以满足市场需求。

此外，若想获得商品化的蛋白酶K产品，下游纯化和冻干技术非常重要，目前在这方面并没有可以借鉴的资料。例如，利用已经报道的纯化方法均不能得到大批量、高产率的蛋白酶K。经过本发明人的测试，这些纯化方法在规模化生产中实用价值不高。

为解决上述问题，本发明人进行了深入的研究，结合了基因突变和真核细胞-酵母外分泌表达技术，从改造蛋白酶K分子结构入手，得到活性提高的基因突变型重组蛋白酶K；优化表达系统，利用酵母细胞外分泌表达技术，大规模发酵高效表达基因突变型重组蛋白酶K，进一步提高蛋白酶K的活性及产量；采用新型蛋白纯化方式，提高蛋白酶K纯化过程中的收率，从而实现了规模化和连续化生产，完成了本发明。目前在专利文件和非专利文件中均未发现关于基因突变型重组蛋白酶K在酵母中工业化生产的报道。

发明内容

野生型蛋白酶K前体由384个氨基酸组成（SEQ ID NO.1，UniProtKB/Swiss-Prot:P06873.2），包括15个氨基酸长度的信号肽、90个氨基酸长度的前肽及279个氨基酸长度的成熟蛋白酶K。

经过国外科学家研究，相比于野生型蛋白酶K，基因突变型重组蛋白酶K可以具有较高的活性。本发明人从野生型蛋白酶K的氨基酸序列（SEQ ID NO.2，由369个氨基酸组成，包括90个氨基酸长度的前肽及279个氨基酸长度的成熟蛋白酶K）中挑选了八个关键位点，合成基因并在真核系统表达成功，得到了酶活大大提高的基因突变型重组蛋白酶K。

因此，本发明的第一方面在于提供一种基因突变型重组蛋白酶K，其特征在于：

（1）将野生型蛋白酶K氨基酸序列（SEQ ID NO.2）中第151位的Y突变为A、第208位的K突变为H、第273位的S突变为T、第293位的G突变为A、第332位的K突变为R、第337位的S突变为N；任选地，还进行下述任意1种以上的突变：

（2）将第123位的S突变为A；

（3）将第180位的L突变为I。