[发明专利]一种黑莓组培苗叶片高效循环再生的方法

权利要求书

1.一种黑莓组培苗叶片高效循环再生的方法，其特征在于包括以下步骤：①大田黑莓茎段外植体的获取、消毒，②茎段不定芽的诱导发生，③不定芽的继代培养；④不定芽苗叶片的循环使用；⑤不定芽的生根诱导；⑥试管苗的炼苗、移栽。

2.权利要求1所述的步骤①，其特征在于：外植体茎段的获取、消毒的方法：以黑莓一年生枝条的半木质化茎段为外植体，用浓洗衣液浸泡冲洗后，在体积比为(70～75)％的酒精中浸(30～60)s，用无菌水冲洗3～5次，再用(0.1～0.2)％升汞浸泡(5～8)min。

3.权利要求1所述的步骤②，其特征在于：诱导茎段产生不定芽的方法：将外植体切成(1.0～1.5)cm长的带芽茎段，接种于不定芽诱导培养基上，培养(20～40)d；所述的诱导茎段形成不定芽的培养基为：MS+6-BA(0～0.5)mg/L+ZT(0.5～1.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂5.6g/L，pH值5.8～6.2。

4.权利要求1所述的步骤③，其特征在于：不定芽的继代培养的方法：将步骤②诱导产生的不定芽接种在继代增殖培养基上增殖，每隔(20～30)d继代1次；所述的不定芽的继代增殖培养基为：MS+6-BA(0～0.2)mg/L+TDZ(0～0.1)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂5.6g/L，pH值5.8～6.2。

5.权利要求1所述的步骤④，其特征在于包括以下步骤：

(1)组培芽苗及其叶片的选择：选步骤③中继代2次以上的组培芽苗作为循环使用的叶片离体再生材料，当组培芽苗长至3叶以上时，选择最长边×最宽边为0.5cm×0.5cm以上的叶片，去掉边缘，剪成(0.4～0.8)cm×(0.4～0.8)cm大小的叶块；

(2)诱导叶片形成愈伤组织：将步骤(1)修剪好的叶片背面紧贴于培养基表面，先在温度(25±3)℃的条件下暗培养(10～15)d，当叶片边缘开始卷曲膨大产生少量愈伤颗粒时，转到光照度(1000～2000)lx、光照时间(12～14)h/d的条件下，培养(15～20)d后形成淡黄色、致密的愈伤组织；所述的诱导叶片形成愈伤的培养基为：MS+TDZ(0.1～1.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

(3)诱导愈伤组织分化不定芽：将步骤(2)所得愈伤组织取下，切成(0.3～0.6)cm×(0.3～0.6)cm的块状，接种到愈伤组织分化培养基上，在培养室温度(25±3)℃、光照度(1500～3000)lx、光照时间(12～14)h/d的条件下培养(25～35)d；所述的愈伤组织分化的培养基为：MS+6-BA(0.5～2.0)mg/L+TDZ(0～1.0)mg/L+IAA(0～0.5)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

(4)不定芽的继代增殖：将步骤(3)获得的不定芽转接于继代增殖培养基中，在培养室温度(25±3)℃、光照度(1500～3000)lx、光照时间(12～14)h/d的条件下培养(20～30)d；所述的不定芽继代增殖培养基为：MS+6-BA(0.5～2.0)mg/L+蔗糖(25～30)g/L+琼脂5.6g/L，pH值5.8～6.2；

(5)不定芽的壮苗培养：将步骤(4)中株高大于1.5cm的不定芽转接于壮苗培养基中，在培养室温度(25±3)℃、光照度(1500～3000)lx、光照时间(12～14)h/d的条件下培养(15～20)d；所述的不定芽壮苗的培养基为：MS+6-BA(0.3～0.5)mg/L+NAA(0.05～0.2)mg/L+蔗糖(20～25)g/L+琼脂5.6g/L，pH值5.8～6.2。

6.权利要求1所述的步骤④中愈伤组织分化所得不定芽苗的叶片离体循环再生，其特征在于：选择继代2 次以上的组培芽苗的叶片作为循环使用的离体再生材料。

7.权利要求1所述的步骤④中壮苗培养所得不定芽苗的叶片离体循环再生，其特征在于：选择壮苗培养所得优质不定芽苗的叶片作为循环使用的离体再生材料。