[发明专利]微孔阵列芯片及其制造方法

说明书

本申请是申请日为2004年9月22日，申请号为200480034519.6的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明的第一方案涉及可用于抗原特异性淋巴细胞等生物体细胞的检测等的微孔阵列芯片。本发明的第一方案特别涉及可容易地进行微孔定位的微孔阵列芯片(Microwell Array Chip)。

本发明的第二方案涉及微孔对生物体细胞的捕集率和收集率均优异的微孔阵列芯片及其制造方法。

本发明的第三方案涉及可用于抗原特异性淋巴细胞等生物体细胞的检测等的硅制微孔阵列芯片。本发明的第三方案特别涉及根据需要，可容易地将容纳在微孔中的生物体细胞进行回收的微孔阵列芯片。

背景技术

以往，抗原特异性淋巴细胞通过例如使用96孔板，每孔加入约200,000个淋巴细胞，在抗原存在下培养3天至一周，由此进行检测(“リンパ球机能检索法”矢野纯一、藤原道夫编著，中外医学社(1994年)；“免疫实验操作法I、II”右田俊介、绀田进、本庶佑、滨冈利之编集，南江堂(1995年))。该方法中，可确认约200,000个淋巴细胞群中存在抗原特异性淋巴细胞。但是无法鉴定存在于淋巴细胞群中的各抗原特异性淋巴细胞。

对于此，近年来人们开发利用了通过将用荧光染料标记的抗原分子与淋巴细胞混合，来使荧光标记抗原与抗原特异性淋巴细胞的抗原受体结合，再使用流式细胞仪检测结合有荧光标记抗原的淋巴细胞的方法(Altman JD，Moss PA，Goulder PJ，Barouch DH，McHeyzer-Williams MG，Bell JI，McMichael AJ，Davis MM.Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes(抗原特异性T淋巴细胞的表型分析)，Science，274：94-96，1996)。该方法可以鉴定与抗原结合的1个淋巴细胞。还可以分选1个与抗原结合的淋巴细胞。

但是，上述检测方法中，为了分选，必须有细胞分选仪这样高价且复杂的仪器，并且还有以下的问题。

(1)用于分选的仪器条件设定较难，用于分选细胞的仪器操作必须熟练。

(2)由于背景噪声高，抗原特异性淋巴细胞的频度为0.1％以下时，无法检测抗原特异性淋巴细胞。

(3)分选细胞的效率低。

(4)分选频度低的细胞需要时间。

(5)可以确认有抗原结合，但难以对结合有抗原的淋巴细胞的反应进行分析。

作为其它的抗原特异性淋巴细胞检测法，还开发出通过将与磁珠结合的抗原分子与淋巴细胞混合，使结合有磁珠的抗原与抗原特异性淋巴细胞的抗原受体结合，使用磁石分选抗原特异性淋巴细胞的方法(Abts H，Emmerich M，Miltenyi S，Radbruch A，Tesch H，CD20positive human B lymphocytes separated with the magnetic sorter(MACS)can be induced to proliferation and antibody secretion in vitro.Journal of Immunological methods 125：19-28，1989.)。

该方法无需复杂的装置，细胞分选所需的时间短，可以确认有抗原结合。但无法对结合有抗原的淋巴细胞是否与抗原反应(细胞内信号转导、RNA合成、蛋白质合成等细胞的代谢生理反应)进行分析。另外，抗原特异性淋巴细胞的频度为0.1％以下时，无法检测抗原特异性淋巴细胞。

而本发明人对于提供无需复杂的装置、细胞分选时间短、可确认有抗原结合、也可检测频度低的抗原特异性淋巴细胞(0.001％以上)、可以对结合有抗原的淋巴细胞是否与抗原反应进行分析、并且可分选抗原特异性淋巴细胞的抗原特异性淋巴细胞检测方法进行了各种研究。对个别检测一个个淋巴细胞的抗原特异性、并且回收检测出的抗原特异性淋巴细胞的方法进行了开发。

但是，目前为止尚未知有可个别检测一个个淋巴细胞的抗原特异性，并可回收所检测的抗原特异性淋巴细胞的微孔阵列芯片。