[发明专利]一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，尤其涉及一种植物表达载体及培育低植酸水稻的方法。

背景技术

植酸(PA，phytic acid)，又名肌醇六磷酸(myo-inositol-1，2，3，4，5，6-hexakisphosphate，简写InsP6或IP6)，广泛存在于禾谷类、豆类、坚果、油料作物的种子中，是植物磷的主要储存形式。在植物体内，植酸及其衍生物承担着多种生理功能，如在种子发育过程中储藏磷、能量等，在种子萌发时向种子提供无机磷。此外，植酸及其衍生物也参与细胞内的信号转导、能量转换、ATP代谢及抗逆性等过程。然而，由于人和非反刍动物(猪、鸡、鱼等)肠胃内缺乏消化植酸及植酸盐的相关酶，因此以禾谷类、豆类等为主食的人类和饲用动物的排泄物中磷的含量很高，极易造成环境水体富营养化；同时植酸与Zn²⁺、Ca²⁺、Fe³⁺等形成的植酸盐不能被人和非反刍动物所吸收利用，造成这些微营养的生物有效性下降。因此，通过遗传育种或者基因工程技术获得植酸含量适当下降、其他农艺性状没有显著变异的作物，不仅能够提高食物的营养价值，同时对于保护生态环境有重要的社会意义。

V.Raboy等(1996)采用化学诱变剂处理玉米，培育了两类低植酸突变体lpa1和lpa2，植酸含量分别下降66％和30％。随后应用γ射线和化学诱变剂在大麦、水稻、小麦、大豆等作物获得了多种植酸突变体和品种，这些突变体和品种的种子植酸含量下降幅度从30到90％不等。然而研究发现，伴随着种子中植酸含量下降，作物的其他农艺性状也会发生改变，如作物减产、种子活力下降、植株形态改变，甚至会影响植物对病原菌的抗性，严重的还会导致致死突变。因此，获得作物种子植酸含量下降而其他农艺性状没有显著变异的低植酸品种成为摆在育种家面前的难题。

到目前为止，植物植酸代谢途径已经了解比较清楚，参与植酸代谢的多个功能基因已经被报道。包括：将光合作物产物葡萄糖-6-磷酸转化成1D-肌醇-3-磷酸的MIPS基因；负责肌醇和3-磷酸肌醇之间转化的MIK和IMP基因；参与肌醇磷酸化的IPK1和IPK2基因；承担运输植酸到贮藏小泡的MRP5(水稻)基因；将植酸水解为肌醇和无机磷的植酸酶基因。目前功能研究最为详细的是MIPS基因，并通过基因沉默技术在多种作物中获得了相应的低植酸突变体。Ruth Keller等(1998)应用组成型启动子和反义RNA技术，获得了MIPS基因表达水平下降的转基因土豆，分析发现转基因土豆叶片中肌醇的含量下降；Aline C.S.Nunes等(2005)通过RNAi技术沉默MIPS基因使大豆中的植酸含量下降了94.5％；Mio Kuwano等(2008)通过反义RNA技术在种子特异性启动子的驱动下，获得了植酸含量下降、其他农业性状没有显著变异的转基因水稻。此外，Shi等(2007)应用RNAi技术，在玉米种子特异性启动子Ole16和Glb驱动下，通过沉默MRP4基因获得种子植酸含量下降的玉米和大豆。目前还没有通过RNAi技术沉默其他植酸代谢相关基因，培育低植酸水稻或其他作物的报道。

发明内容

本发明提供了一种植物表达载体，利用该植物表达载体能特异性地抑制水稻种子中相应植酸代谢相关基因MIK的表达，从而获得性状稳定的低植酸水稻植株。

一种RNAi抑制水稻MIK基因表达的植物表达载体，包括插入原始载体的发夹结构单元和特异性启动子，所述特异性启动子为启动子Oleosin18，其核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。MIK基因来自于水稻，其基因序列号；LOC Os03g52760，其序列如SEQ ID No.8所示。

本发明植物表达载体使用种子特异性启动子Oleosin18，可以使基因沉默事件仅发生在种子胚和糊粉层，能够有效地避免其他组织部位植酸合成受到影响。

所述发夹结构单元包括中间的内含子及两端的目的基因片段和目的基因片段的反向互补片段，所述目的基因片段为MIK基因cDNA序列的部分序列，MIK基因的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示。内含子在本发明中没有特异性的要求，它可以来自菜豆亚硝酸还原酶基因(基因序列号：U10419.1)，碱基序列如SEQ ID NO.3所示。扩增所述目的基因片段的引物为引物MIKRNAi-F和MIKRNAi-R如下：

MIKRNAi-F：5’-TACTTGAGAAGGCAGTAAAACGAC-3’；

MIKRNAi-R：5’-AGAGCACATAATTCAACAGAGAGC-3’；