[发明专利]一种肽的固相合成方法及其合成的肽

说明书

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种含不对称二硫键的肽的固相合成方法，以及由此方法合成的肽。

背景技术

二硫键(disulfide)在蛋白质及多肽分子中对保持其生物活性和构象稳定有着举足轻重的作用。含有二硫键的小分子肽通过溶液法或固相合成法合成时，通常是将脱保护的线性肽链中的两个半胱氨酸(Cys)残基的巯基氧化成二硫键。两个半胱氨酸形成一个二硫键的方法有很多，例如，中国专利申请CN102336808A报道了一种奥曲肽二硫键氧化环合的方法，其采用醋酸铵缓冲液作为氧化工作液，在pH 7.5-8.5下，将合成的奥曲肽前体直八肽氧化成环八肽，所述方法氧化条件温和，副反应少，产物纯度高，最后产品收率高，适用于规模化生产。当多肽分子含多对Cys残基时，二硫键的形成受许多因素影响，可能导致形成多种异构体，产物的产率降低，且给分离纯化带来许多麻烦。

现有技术中没有不对称二硫键的合成方法，而实际多肽药物中有许多含有不对称二硫键的药物。因此，需要一种含不对称二硫键的肽的合成方法。

发明内容

本发明提供了一种含不对称二硫键的肽的合成方法，其包括以下步骤：

(1)合成与固相载体2-三苯甲基氯树脂相连接的肽，所述肽包含三个或三个以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的残基，其中两个所述半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链各自被S-烷基-硫基保护基团保护，其中所述烷基为未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其卤代变体或卤素进一步取代，其中两个保护基为相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链被三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保护基团保护，

(2)使所述肽与S-烷基-硫基保护基团去除剂反应，

(3)使所述肽在氧气存在下且在无非均相催化剂存在下形成不对称二硫键，

(4)裂解肽树脂得到含不对称二硫键的肽。

此外，本发明还提供一种合成的含不对称二硫键的肽，其具有以下通式：

其中，m，n＝1或2，其中Y＝H或Y是第一保护基团，o为0-50，x为2-50，q＝0-50，其中R₁(o)、R₂(x)、R₃(q)各自独立地是选自以下的氨基酸的侧链：天然氨基酸，包括环氨基酸；非天然氨基酸，包括环氨基酸或非酰氨结合的二肽基区段，天然氨基酸的非天然衍生物或其类似物，其中所述氨基酸链各自不包含或包含第二保护基团，各侧链的第二保护基团相同或不同，A是树脂或树脂连接臂，R₁₀、R₁₁各自为烷基，该烷基为未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其卤代变体或卤素进一步取代，这些烷基相同或不同。

本发明的方法简单，所述方法通过定位氧化在肽分子中形成不对称二硫键，其定向效率高，因而产生的副产物少。

具体实施方式

本发明提供了一种含不对称二硫键的肽的合成方法，其包括以下步骤：

(1)合成与固相载体2-三苯甲基氯树脂相连接的肽，所述肽包含三个或三个以上的半胱氨酸或高半胱氨酸的残基，其中两个所述半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链各自被S-烷基-硫基保护基团保护，其中所述烷基为未被取代的或被芳基、芳氧基、烷氧基、其卤代变体或卤素进一步取代，其中两个保护基为相同或不同，其中其余的半胱氨酸或高半胱氨酸的侧链被三苯甲基-、叔丁基-、乙酰氨基甲基-、烷基化的乙酰氨基甲基-、烷基化的三苯甲基-保护基团保护，

(2)使所述肽与S-烷基-硫基保护基团去除剂反应，

(3)使所述肽在氧气存在下且在无非均相催化剂存在下形成不对称二硫键，

(4)裂解肽树脂得到含不对称二硫键的肽。

在一个优选实施方案中，本发明的方法还包括在步骤(4)后采用HPLC方法纯化所述肽，最终得到精肽；优选所述纯化方法为：将所述肽经过滤后用以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以三氟乙酸(TFA)水溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化，其中流动相A相为体积比为0.1％TFA水溶液，B相为纯乙腈。