[发明专利]苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法

说明书

技术领域

   本发明涉及β-肾上腺素受体激动剂检测技术领域，特别是涉及苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法。 

背景技术

近年来，接连不断的瘦肉精事件已成为中国食品安全领域挥之不去的幽灵。去年，湖南省成功破获一起涉及福建、湖南、浙江三省的瘦肉精生产、销售案件，并从饲料中检测出以前从未出现过的苯乙醇胺A，这种瘦肉精新品种的出现，再次敲响了我国食品安全警钟。 

苯乙醇胺A，又称“克伦巴胺”，可被非法添加于猪和牛的饲料中，有刺激动物生长，加强蛋白质在动物体内沉积，提高基础代谢水平，使体脂趋于分解等作用，也可促进猪生长速度加快、使其皮红毛亮、瘦肉率提高。人食用含这种瘦肉精的肉后，会出现恶心、头晕、四肢无力、手颤等中毒症状，甚至诱发高血压、心脏病等。因此，近期被农业部第1519号公告列为“禁止在饲料和动物饮水中使用的物质”。 

现有技术对于苯乙醇胺A的检测主要是高效液相色谱-串联质谱法、高效液相色谱法等检测方法，但这些技术的缺陷明显：设备昂贵、操作复杂、难以推广。所以，建立一种简单、有效、适合基层使用的测定方法是极其必要的。本发明的目的是研制一种更适合企业进行现场检测且快捷简便、成本低廉的定性检测方法。 

发明内容

针对以上情况，本发明的目的就是为了克服现有技术存在的缺陷而提供一种苯乙醇胺A的免疫胶体金检测卡及其制备方法，可有效解决能快速、简便地检测出β-肾上腺素受体激动剂苯乙醇胺A的问题。 

本发明的苯乙醇胺A胶体金检测卡，包括包被了单克隆抗体胶体金标记物的胶体金结合垫、包被了苯乙醇胺A-BSA和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、样品垫、吸水垫、PVC胶板和塑料模具组成，在PVC胶板的一端依次粘附样品垫、结合垫，中间黏贴硝酸纤维素膜，另一端粘附吸水垫。 

本发明的苯乙醇胺A胶体金检测卡的制备方法，是由以下步骤实现： 

(1)胶体金溶液制备：取1 L 三角烧瓶1个，加入超纯水495 mL，而后加入1%氯金酸(HAuCl₄·3H₂O) 5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加热煮沸后在持续搅拌的情况下加入1%柠檬酸三钠(Na₃C₆H₅O₇·2H₂O)溶液5-7 mL，继续搅拌加热，当溶液的颜色完全变为透明的紫红色时，维持5 min后停止加热，补水至原体积，冷却至室温，2-8℃保存备用；

(2)抗体的预处理：将要标记的苯乙醇胺A抗体在1000 r/min, 4℃条件下，离心20 min，取上清，用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL；或者用0.01 mol/L PBS稀释成1 mg/mL，过0.22 μm滤膜；

(3)胶体金标记物的制备：取步骤(1)中的胶体金溶液40 mL，用0.25 mol/L K₂CO₃调节胶体金溶液pH至 8.5，电磁搅拌器250 r/min搅拌，逐滴加入4 mL 含0.3 mg 抗体蛋白的蛋白溶液，反应10 min；逐滴加入4 mL 10% BSA，继续搅拌反应10 min；金标抗体溶液常温低速（1500 r/min）离心10 min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀；红色上清溶液4℃，12000 r/min 离心20 min，弃上清，收集沉淀，将沉淀用金标抗体稀释液定容至1 mL，制备成苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物；

(4)胶体金膜的制备：将步骤(3)苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物用划膜仪以5 μL/cm的浓度均匀喷在载体玻璃纤维素膜上，室温自然晾干或者37℃烘干3 h，制成含苯乙醇胺A单克隆抗体胶体金标记物的胶体金膜；

(5)包被膜制备：将羊抗鼠IgG抗体、苯乙醇胺A蛋白质偶联物稀释成1 mg/mL，用划膜仪依次以1 μL/cm的浓度喷涂在硝酸纤维素膜上，制备成包被膜，37℃包被2 h后，室温自然晾干或者37℃烘干；

(6)样品垫前处理：将样品垫处理液均匀涂布在玻璃纤维素膜上，在空气湿度低于60%的条件下，室温自然晾干；

(7)检测卡的组装：PVC胶板自上而下依次粘贴样品垫、胶体金膜、包被膜和吸水垫，组装成试纸条，切割成一定宽度的长条，再将试纸条安装在长条扁平壳状的检测卡外壳中。

所述步骤(5)中所包被的检测线T设在质控线C的下方；