[发明专利]特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

细胞色素P450酶(Cytochrome P450, CYP450)是一类重要的混合功能氧化酶系统，主要分布在生物体的内质网上和线粒体中，参与许多内源性和外源性物质的生物转化过程。CYP3A4属于CYP450家族中的CYP3A亚族，由CYP3A4基因编码，主要存在于肝脏中，约占肝脏CYP酶总量的30-40%，是肝脏中含量最丰富的CYP，也是最重要的人类药物代谢酶。CYP3A4参与代谢大约38类多于150种的临床治疗药物，包括抗生素、抗真菌药物、安定药物、抗组胺剂、抗抑郁药物、激素以及钙拮抗剂等等，此外，CYP3A4还参与一些前体致癌物的激活过程。因为其广泛的代谢底物谱，许多药物不良反应是由药物相互作用导致CYP3A4的代谢活性改变所引起的。

现有技术中，阮昊和徐田雪分别将CYP3A4基因cDNA片段连接到了pFastBac载体上，并将其包装成杆状病毒后感染sf9细胞，得到了能表达CYP3A4基因的sf9细胞，该细胞能够用于体外研究药物代谢，但因不是人源细胞不适用于外源物质对人毒理的相关研究；李敏将CYP3A4基因cDNA片段连接到了pYES2/CT-PCR载体上并将其导入到酿酒酵母BJ5628中实现CYP3A4的稳定表达，但因非人源细胞也不适用于外源物质对人毒理的相关研究。现有技术中尚无可在人源细胞中持续、稳定且高效表达CYP3A4基因的载体。

发明内容

为解决现有技术中存在的问题，发明人在载体的选择、重组构建方法等方面进行了大量的探索研究，预料不到地发现，将包含Xho I酶切位点和Xma I酶切位点的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表达载体的多克隆位点中可成功构建特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，从而完成本发明。

本发明提供一种特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体，包括pLVX-AcGFP-C1表达载体的基本序列、抗性基因序列、多克隆位点序列、启动子序列和CYP3A4基因cDNA序列；所述多克隆位点包括Xho I酶切位点和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列包括Xho I酶切位点、CYP3A4基因编码序列和Xma I酶切位点，所述CYP3A4基因cDNA序列正向插入所述多克隆位点序列中。

采用上述技术方案，本发明提供的CYP3A4基因cDNA序列插入pLVX-AcGFP1-C1表达载体构建得到的慢病毒表达载体具有转染效率高，用量少，可持续、高效、稳定地提高CYP3A4基因表达的优点，可作为有力工具应用于制备治疗CYP3A4基因表达异常相关疾病药物的研究和开发中。

作为本发明的进一步改进，所述CYP3A4基因编码序列通过PCR扩增获得，PCR引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的序列为：5’-CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即SEQ ID NO：1，所述下游引物的序列为：5’-ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC-3’，即SEQ ID NO：2。采用上述PCR引物序列，通过PCR可以扩增出CYP3A4基因编码序列，并可成功插入至pLVX-AcGFP1-C1表达载体中持续表达CYP3A4基因，减少了序列合成费用，成本较低。

相应的，本发明还提供特异促进肝细胞CYP3A4基因高表达的慢病毒表达载体的构建方法，包括如下步骤：

A） CYP3A4基因引物设计：根据CYP3A4基因编码序列，使用Oligo 7分析后选取5’-CCGCTCGAGACATGGCTCTCATCCCAGACTT-3’，即SEQ ID NO：1作为上游引物，选取5’-ACCCGGGTCAGGCTCCACTTACGGTGCCATCC -3’，即SEQ ID NO：2作为下游引物，然后合成所述上游引物和所述下游引物；所述上游引物和所述下游引物无引物二聚体，且退火温度差距较小；