[发明专利]一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法

说明书

技术领域

本发明涉及铁皮石斛的组培技术领域，尤其涉及一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法。

背景技术

铁皮石斛，被誉为“中华九大仙草之首”，为兰科多年生草本植物。生于山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，不耐高温、干燥，不耐寒。铁皮石斛为石斛之极品，它因表皮呈铁绿色而得名，具有益胃生津，滋阴清热等药用价值。

铁皮石斛种子微小，自然萌发率和繁殖率低，生产上的种苗均来自组织培养。目前，铁皮石斛的组培育苗主要通过原球茎诱导、幼苗分化与壮苗培养3个阶段来实现，培养时间较长、成本较高。因此，如何缩短培养时间、提高培养效率、降低培养成本已成为促进铁皮石斛产业加速发展的当务之急。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：一种铁皮石斛组织培养一步成苗的方法，包括以下步骤：

（1）制备成苗培养基：以B5为基础培养基，每升B5培养基中添加0.1mg的6-苄氨基嘌呤、0.3mg的α-萘乙酸、2.0g的活性炭、3.5g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6.0，得成苗培养基；均匀地将成苗培养基分装于培养容器中，边分装边搅拌，避免活性炭沉底，分装完毕后加盖；培养容器加盖后，放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：121℃下灭菌20分钟，灭菌后取出培养容器，冷却后备用；

（2）铁皮石斛果实灭菌：将铁皮石斛果实放入水中清洗干净；在无菌条件下，将铁皮石斛果实在体积百分比浓度为75%的乙醇溶液中浸泡1分钟，取出用无菌水清洗若干遍，放入体积百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液灭菌10分钟，再用无菌水清洗若干遍，吸干水分后放入无菌培养皿中备用；

（3）接种：解开铁皮石斛果实的果皮，把种子均匀地洒在成苗培养基表面，盖紧盖子；

（4）培养：将完成接种的培养容器移入培养室，培养条件为：温度25℃，光照时间每天12小时，光照强度l500～2000lx，培养时间约为3个月，得到0.5-1.0 cm的幼苗； 

（5）转接：首先配置壮苗培养基：每升B5培养基中添加0.5mg 的6-苄氨基嘌呤、1.0mg的α-萘乙酸、3.0g的活性炭、3.0g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6.0，得状苗培养基；然后将幼苗转接至壮苗培养基，继续培养，直至苗高5-6cm时，移栽至大棚。

本发明的有益效果是：本发明通过合理掌控两种激素用量及相互间的配比，以及其他辅料的添加，促进铁皮石斛种子一步成苗，而不必经过原球茎阶段，缩短培养时间2个月左右，降低了经济成本。转接结果也表明，一步成苗培养成的组培苗长势旺盛，符合生产所需，可作为铁皮石斛生产种苗的重要来源。

具体实施方式

本发明铁皮石斛组织培养一步成苗的方法，包括以下步骤：

1.成苗培养基准备

（1）配制：以B5为基础培养基，每升B5培养基中添加0.1mg 的6-苄氨基嘌呤、0.3mg的α-萘乙酸、2.0g的活性炭，3.5g的琼脂和30g的蔗糖，加热至沸腾，加热过程中搅拌，待琼脂完全溶解后，调节pH值至6.0，得成苗培养基。

（2）分装：均匀地将培养基分装于培养容器中，边分装边搅拌，避免活性炭沉底，分装完毕，加盖。

（3）灭菌：培养容器加盖后，及时放入高压灭菌锅内灭菌，灭菌条件为：121℃下灭菌20分钟，灭菌后及时取出培养容器，冷却后备用。

2.外植体灭菌

先清洗：将外植体铁皮石斛果实放入清水中，加少许洗洁精，清洗果实表面，后用流水冲洗干净。

灭菌：事先将镊子和烧杯灭菌，在无菌条件下，用镊子将果实在体积百分比浓度为75 %的乙醇溶液中浸泡1 分钟，取出用无菌水清洗2遍，放入体积百分比浓度为2%的次氯酸钠溶液灭菌10 分钟，再用无菌水清洗6遍，吸干水分，放入无菌培养皿中备用。

3.接种

用无菌解剖刀解开铁皮石斛果实的果皮，把种子均匀地洒在培养基表面，立刻盖紧盖子。

4.培养

将完成接种的培养容器移入培养室，培养条件为：温度25℃，光照时间每天12小时，光照强度l500～2000lx，培养时间约为3个月，得到0.5-1.0 cm的幼苗；培养期间要勤检查，发现污染及时移除。

5.转接