[发明专利]一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术和病毒学领域。具体涉及一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒，还涉及一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒的制备方法，还涉及一种猪圆环病毒2型重组杆状病毒在制备预防猪圆环病毒感染灭活疫苗中的应用。利用本发明的重组病毒表达人工修饰的猪圆环病毒2型ORF2基因并组装成猪圆环病毒2型样病毒颗粒VLP，可以用于制备圆环病毒安全疫苗。

背景技术

猪圆环病毒2型(porcine circovirus 2，PCV2)是90年代初发现的一种无囊膜的单股负链DNA病毒，属于圆环病毒属。PCV2能引起仔猪断奶多系统衰竭综合征(PMWS)、猪呼吸疾病综合征(PRDC)、猪皮肤和肾病综合征(PDNS)、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等多种疾病，给养猪业造成巨大的经济损失。同时，PCV2能够导致感染猪获得性免疫抑制（Darwich et al.,2002;Segales et al.,2004），往往导致与猪细小病毒，猪繁殖与呼吸综合症病毒，猪伪狂犬病毒等病原的混合感染。PCV2基因组全长1767/1768bp，同基因型的病毒内部基因组变异不大，同源性在95%以上。PCV的基因组共编码11个开放阅读框架（op en reading frames,ORFs）,ORF1~ORF11,其中ORF2编码病毒的唯一结构蛋白——核衣壳蛋白（Cap），该蛋白由234个氨基酸组成，分子量为28kDa,可自我装配成病毒样粒子。Cap是主要的免疫原性蛋白并能诱导特意的PCV2中和抗体(Pogranichnyy et al.,2000)，因此ORF2基因是设计PCV2新型疫苗的首选目标基因。Liu等（2001）通过大肠杆菌表达ORF2基因，证明其具有很强的免疫原性；在杆状病毒表达ORF2基因后可以形成圆环病毒样颗粒（Nawagitgul,2000）。

杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒（Autographa califonica mult iple nuclear polyhedrosis virus,AcMNPV）。AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Anderson et al.,1995；Wang et al.,2001；Ribeiro et al.,2001)。

PCV2相关性疾病，在2005年给欧洲造成的经济损失高达6亿欧元。同样我国每年因为PCV2感染给我国养猪业带来巨大经济损失，目前对PCV2感染的控制主要通过加强饲养管理和生物安全措施，但是PCV2在猪群中感染率较高以及PCV2对外界环境的抵抗力较强，因而通过安全有效地疫苗免疫预防PCV2感染显得十分重要。PCV2在细胞上的增值滴度非常低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗的前景不大。因而研制安全高效的新型疫苗在PCV2的疫苗开发中占重要地位。近年来发展起来的病毒样颗粒疫苗（Virus like particles,VLP），含有病毒的一个或多个抗原蛋白、具有与病毒粒子相似结构的颗粒，不含有病毒的遗传物质，不能自主复制、没有感染性，能以天然构象和模式递呈抗原，有效刺激体液和细胞免疫，诱导机体产生良好的免疫保护。鉴于杆状病毒表达载体的优势和病毒样颗粒疫苗的特性，利用杆状病毒载体表达系统在昆虫细胞中大量表达PCV2ORF2基因，并成功组装成病毒样颗粒VLP，以此制备灭活疫苗，为PCV2感染相关疾病(如仔猪断奶多系统衰竭综合症等)的免疫防制提供重要的候选疫苗株。

发明内容

本发明的一个目的是提供了一种人工修饰合成的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus 2，PCV2)ORF2基因的cDNA序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。

本发明的另一个目的是提供一种转移载体pFBDPHm3ORF2，该载体含有3个拷贝PCV2免疫原性基因ORF2的cDNA序列和标记基因eGFP。