[发明专利]一组特异识别黄曲霉毒素B1的寡核苷酸适配子

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及到利用分子生物学技术中的SELEX技术(指数富集的配体系统进化技术)制备一组与黄曲霉毒素B₁高特异性和高亲和力的核酸适配予，为该核酸适配子在检测黄曲霉毒素B₁中的应用提供科学依据和理论基础。 

背景技术

黄曲霉毒素(aflatoxins，AF)主要是黄曲霉菌和寄生曲霉菌的二次代谢产物，其化学结构类似，均为二氢呋喃香豆素的衍生物。目前已确定黄曲霉毒素结构的有AFB₁、AFB₂、AFM₁等18种，它们的基本结构中都含有二呋喃环和氧杂萘邻酮(又名香豆素)，前者为其毒性结构，后者可能与其致癌有关。黄曲霉毒素耐高温，通常加热处理对其破坏很小，只有在熔点温度下才发生分解。黄曲霉毒素遇碱能迅速分解，但此反应可逆，即在酸性条件下又复原。在温暖潮湿气候地区的粮食和饲料，凡被黄曲霉菌和寄生曲霉菌污染都可能存在黄曲霉毒素。黄曲霉毒素最易污染花生、玉米、棉籽、禽蛋、肉、奶及奶制品，其次是小麦、高粱和甘薯，大豆粕被黄曲霉毒素污染的程度轻些。我国粮食和饲料被黄曲毒素污染率很高，给饲料企业和养殖业主带来了很大损失。1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织(WHO)的癌症研究机构划定为1类致癌物，是一种毒性极强的剧毒物质。黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，在天然污染的食品中以黄曲霉毒素B₁最为多见，其毒性和致癌性也最强，其致癌力是奶油黄的900倍，比二甲基亚硝胺诱发肝癌的能力大75倍，比3，4-苯并芘大4000倍。它主要诱使动物发生肝癌，也能诱发胃癌、肾癌、直肠癌及乳腺、卵巢、小肠等部位的癌症；其毒性远远高于氰化物、砷化物和有机农药，比氰化钾大100倍，比砒霜大68倍。因此，如何快速、准确检测出黄曲霉毒素B₁具有重要研究意义。 

目前，对真菌毒素B₁的检测方法应用最多的是抗原抗体法即免疫学方法，但这种方法需要制备特异性的抗体，抗体具有不稳定性，制备的成本较高而且不宜保存，受免疫原性等的限制。这些不足制约了免疫学方法在真菌毒素领域中的应用。而且目前存在的检测方法检测限普遍较高，不适合真菌毒素中毒具有隐蔽性和微量性的特点。因此，建立新的对真菌毒素尤其是黄曲霉毒素B₁为典型代表的快速而灵敏的检测方法尤为必要。 

近些年来，寡核苷酸适配子作为抗体分子的前景性替代分子，其研究较为引人注目。寡核苷酸适配子是通过SELEX过程筛选的与靶物质特异性结合的一簇小分子DNA或RNA片段。SELEX技术(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，系统进化指数富集技术)是20世纪90年代初研制的一种新的组合化学技术，是一种研究核酸结构和功能的有效方法。其基本原理是体外化学合成一个随机单链寡核苷酸库，用它与靶物质混合形成靶物质-核酸复合物，洗去未与靶物质结合的核酸分子，分离与靶物质结合的核酸分子，以此核酸分子为模板进行PCR扩增，再进行下轮的筛选过程。通过数轮重复筛选与扩增，最后得到高亲和力和高特异性的寡核苷酸适配子即Aptamer。利用SELEX技术筛选获得的Aptamer识别分子的模式与蛋白抗体类似，但与蛋白类抗体相比，适配子具有更明显的优越性，如不依赖动 物细胞，不受免疫条件和免疫原性限制，适配子的筛选完全在体外进行，具有时间、质量和数量上的选择弹性，可以在合成时精确、定点、随意连接其他功能基团和分子；适配子变性与复性可逆且速度快，可反复使用、长期保存和室温运输；靶分子范围更广，除蛋白质、核苷酸大分子外，还有小分子(如染料、可卡因、咖啡因和茶碱等)、生长因子、肽链、类固醇、糖类、辅因子(如FMN等)，甚至可用于完整的细胞、病毒、孢子等；与靶分子结合具有更强的特异性和亲和力，不受组织或样品中非靶蛋白的干扰，可以在靶目标性质未知的情况下筛选出其相应的适配子；适配子通过占据靶物质表位，使疾病得到控制，作为临床药物的治疗，已显现了潜在的应用前景，已有研究通过SELEX技术筛选到相应靶物质的适配子作为拮抗剂，抑制肿瘤生长时的血管内皮生长因子、血栓生成因子、一些毒素蛋白等的作用，以达到治疗目的。在微生物检测方面，特别是对一些致病性细菌或病毒的研究，虽然不知道其内部结构、功能及这些物质的表位，但将其作为靶物质，通过SELEX过程筛选到与其对应的适配子，检测靶物质，已成为该领域的研究探索热点。