[发明专利]耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白抗原HI2的纯化方法

说明书

技术领域

本发明属于生物制药领域，特别涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗重组蛋白抗原HI₂的纯化方法。 

背景技术

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是能够感染人体任何一个部位的革兰阳性球菌，局部感染经久不愈,全身感染死亡率高达20％，已成为全球ICU病房、烧伤、战创伤等感染率最高的病原菌之一。 

万古霉素是治疗MRSA的最后一道防线，但1997以来年耐万古霉素的MRSA相继被分离出来，使MRSA即将面临无抗生素可治的严峻挑战。因此，加强对MRSA感染的防治研究，已迫在眉睫。因此，研发一种有效的疫苗可能是预防和控制MRSA感染及其耐药性发展有效途径。 

细菌外膜蛋白具有良好的抗原活性，这些外膜蛋白作为抗体和免疫细胞攻击的主要靶标，可以介导对细菌最直接有效的杀灭作用，是决定免疫反应是否对人体具有保护性的关键因素。IsdB不仅是MRSA一个重要外膜铆钉蛋白，在MRSA定植粘附中期重要作用，同时它也是MRSA从宿主获得铁的一个主要工具。以IsdB为组分的基因工程疫苗正在进行Ⅱ期临床试验。此外，金黃色葡萄球菌可通过产生溶血素、凝固酶、杀白细胞素等多种致病因子引起人和动物的多种疾病一溶血素(Hla)便是其中的一种重要的致病因子。Hla是一个在大多数临床分离株上都表达的穿孔形成毒素。它与多种疾病有关如肺炎，败血症关节炎及脑脓疮等。Hla单体约33kDa，以七聚体形式发挥功能，每个单体的110-150氨基酸互相靠拢在磷脂双分子层上形成孔。随后导致细胞膜破坏，胞内离子渗出等。其毒性很强，在很低浓度情况下即可致病。Hla抗血清能够抑制金黃色葡萄球菌的细胞毒性作用，也能降低金黃色葡萄球菌黏附到宿主细胞上的机率。Hla免疫接种后使机体获得抗金黃色葡萄球菌感染的保护作用。 

Hla和IsdB都是MRSA的固有蛋白成分，其编码基因具有高度保守性，是MRSA疫苗重要的候选抗原。我们已经构建了既能很好去除MRSA这些蛋白对细胞的毒性，又能保持这些蛋白抗原性的重组双亚单位基因工程蛋白HI₂。目前尚未见针对（MRSA）重组双亚单位基因工程蛋白HI₂疫苗制备中的纯化方法的报道。 

发明内容

本发明的目的，是提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原HI₂制备中的纯化方法。该方法工艺简单，所获得目标蛋白纯度高，回收率较好。 

本发明采用了以下步骤： 

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程疫苗候选抗原HI2制备中的纯化方法，该抗原HI₂的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其纯化方法包括以下步骤： 

A）收集自构建表达抗原HI₂的大肠杆菌工程菌高密度发酵的菌体； 

B）采用高压破菌、离心，硫酸铵分步沉淀，GST亲和层析、PP酶切，MMC层析、凝胶过滤层析技术的顺序组合对制备的HI2进行纯化，获得了高纯度的rHI2。 

所述步骤B具体如下： 

1）高压破菌：将收集的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌重组双亚单位基因工程蛋白HI₂的大肠杆菌菌体以pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，高速离心，收集上清； 

2）硫酸铵分步沉淀：4℃搅拌条件下，上清中缓慢加入终浓度为30%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清；上清中继续缓慢加入终浓度为40%的硫酸铵，搅拌半小时，10000-15000g高速离心20分钟，收集沉淀； 

3）沉淀复溶：称量沉淀湿重，按重量：体积比1：10比例加入pH7.0-7.5的10-20mM PBS缓冲液，搅拌混匀10-15分钟，10000-15000g高速离心20分钟，收集上清； 

4）GST亲和纯化：选择GST亲和层析填料进行初步纯化，使用PBS -Tween80pH7.0-7.5条件下对目标蛋白进行纯化，Prescission Protease酶（PP酶）进行酶切洗脱：