[发明专利]一种重组牛朊蛋白bPrP及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种重组牛朊蛋白bPrP及其编码基因和制备方法，以及含有该编码基因的重组表达载体和重组牛朊蛋白bPrP在检测朊病毒病中的应用。 

背景技术

朊病毒（Prion）病，又称为传染性海绵状脑病（TSEs），是一种致死性神经退行性疾病，以脑空泡化、神经元死亡和神经小胶质细胞增生为主要特征。 

朊蛋白与传染性海绵状脑病的的发生密切相关，因此，重组朊蛋白对这类病的诊断试剂的研发及发病机制的研究是必不可少的。目前获得重组朊蛋白的方法都是通过基因工程技术构建朊蛋白表达载体，通过大肠杆菌表达目的蛋白，然后通过复性获得可溶状态的重组朊蛋白。然而这些表达技术在构建载体的环节都存在一个不足：目的片段通过双酶切技术连接在表达载体上之后，上游的酶切位点（构建载体的酶切位点和额外的酶切位点）没有去除，会与目的基因一起被翻译，目的蛋白的N端相应会多出几个氨基酸（≥2），这样的蛋白在一般的研究中，如制备相应抗体等研究中可能会有一定的影响，且在对朊蛋白抗性机制研究的过程中，无法满足精确氨基酸位点的研究工作。迫切需要一种定点消除了酶切位点的全真朊蛋白，为传染性海绵状脑病的抗体研制、疾病检测提供有效的反应原。 

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种消除多余酶切位点的牛朊蛋白。 

本发明的另一目的在于提供一种表达上述蛋白的重组表达载体。 

本发明提供一种重组牛朊蛋白bPrP，其氨基酸序列为： 

（a）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或 

（b）SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经替换、缺失和/或添加一个或几个氨基酸残基形成的具有同等功能的氨基酸序列。 

应当理解，本领域技术牛员可根据本发明公开的蛋白bPrP的氨基酸序列（SEQ ID No.2），在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第108位的赖氨酸（Lysine）替换为丙氨酸（Alanine），将第119位的甘氨酸（Glycine）缺失，不影响其免疫原性。因此，本发明的重组牛朊蛋白bPrP还包括SEQID No.2所示氨基酸序列经取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，具有与重组牛朊蛋白bPrP同等活性的由bPrP衍生得到的蛋白质。 

进一步地，本发明提供了编码重组牛朊蛋白bPrP的基因，是如下a)或b)： 

（a)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示；或 

（b）由SEQ ID No.1所示核苷酸序列经取代一个或几个核苷酸，得到编码bPrP的核苷酸序列。 

进一步地，本发明提供一种重组表达载体，其为含有以重组牛朊蛋白bPrP的编码基因为目的基因的表达盒。 

优选地，本发明的重组表达载体为pPROEX-htb-bPrP。 

本发明提供了含有上述重组表达载体的转基因细胞系及重组菌。 

本发明提供一种构建重组表达载体pPROEX-htb-bPrP的方法，包括以下步骤： 

（1）PCR方法扩增bPrPc基因； 

（2）将PCR产物和载体pPROEX-htb分别用内切酶BamHI和Hind III双酶切；酶切产物连接后转化感受态细胞，挑取阳性菌落，得到前期表达质粒； 

（3）以前期表达质粒为模板，以除去bPrPc基因前酶切位点为目的设计引物，进行PCR反应，将PCR产物转化感受态细胞，选取阳性菌落提取质粒，得到重组表达载体pPROEX-htb-bPrP。 

其中，步骤（1）所述的PCR方法中所用的引物序列分别为： 

上游引物：cgcGGATCCCAAGAAGCGCC CGAAGC，划线部分为保护碱基及BamH I酶切位点, 

下游引物：cccAAGCTTACGATCCTCTC TGGTAATAGG CC，划线部分为保护碱基及Hind III酶切位点； 

50μL反应体系为：10×Buffer 5μL，dNTP4μL，牛全血基因1μL，上、下游引物各2μL，ddH₂O 35μL，高保真DNA聚合酶1μL； 

PCR反应条件为：98℃预变性5min：94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，30个循环；72℃延伸10min。