[发明专利]一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用

权利要求书

1.一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)斑马鱼选取

挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；

(2)细菌注射

设置若干个细菌注射组、1个溶剂注射组、1个空白对照组，将带有荧光标记的细菌用灭菌的1×PBS缓冲液洗脱3次，然后用显微注射的方式将细菌注入斑马鱼体内，注射结束后，洗脱除去残留的麻醉剂，并将斑马鱼转入6孔板中，每孔中加入等体积的养殖用水，作为细菌注射组；溶剂注射组注射等体积灭菌的1×PBS缓冲液；空白对照组注射等体积的养殖用水；恒温培养。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤：

(3)图像分析和/或微孔板分析；

(4)统计学分析。

3.如权利要求1或2所述的建立方法，其特征在于：优选的，步骤(1)中挑选的斑马鱼为受精后2天的斑马鱼；

优选的，步骤(2)中每个斑马鱼细菌注射量为3000-3500CFU；

优选的，步骤(2)中的注射方式为心包注射或卵黄囊注射；

优选的，步骤(2)中细菌为大肠杆菌；

优选的，所述养殖用水其溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28℃、pH为7.2-7.6、总硬度为200-250mg/L；

优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的温度为34℃；

优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的时间为72h。

4.如权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于：

优选的，图像分析具体步骤为：移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为0.64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3％甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3.10高级图像处理软件对图像进行分析，计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度；

优选的，微孔板分析具体步骤为：将斑马鱼转入96孔板，每孔1尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；

优选的，统计学分析步骤为：统计学处理结果以表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’s T-检验进行统计学处理，p＜0.05为差异性显著。

5.权利要求1-4所述构建方法得到的斑马鱼细菌感染模型用于细菌感染研究的用途。

6.权利要求1或3所述构建方法得到的斑马鱼细菌感染模型用于评价或筛选抗生素的用途。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于：还包括以下步骤：

(3)化合物处理

移除微孔板中的养殖用水，设置多个实验组：若干个化合物处理组，1个模型组，1个阳性对照组，化合物处理组中加入相同体积、浓度分别为0.1μM、1μM、10μM、100μM和200μM的化合物；模型组加入等体积的养殖用水；于34℃恒温培养箱中培养；

(4)图像分析和/或微孔板分析；

(5)统计学分析。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于：

优选的，步骤(3)阳性对照组加入的溶液为氨苄西林；

优选的，图像分析具体步骤为：移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为0.64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3％甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3.10高级图像处理软件对图像进行分析，计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度；

优选的，微孔板分析具体步骤为：将斑马鱼转入96孔板，每孔1尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；

优选的，统计学分析步骤为：统计学处理结果以表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’s T-检验进行统计学处理，p＜0.05为差异性显著。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于：

化合物处理后的斑马鱼培养时间为48小时。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于：

所述的化合物为卡那霉素、庆大霉素、氯霉素或链霉素。