[发明专利]胰激肽释放酶的一种制取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种胰激肽释放酶的制备方法，具体地说涉及采用磁性亲和分离技术制备高纯度胰激肽释放酶。

背景技术

1909年Abelous等首次报道静脉注射人尿液可引起狗的血压短暂下降，发现尿中存在降压物质。后来发现它也存在于唾液、血浆及胰腺中，尤其后者含量为最高，1930年被命名为激肽释放酶(Kallikrein)。胰激肽释放酶可以从哺乳动物胰腺、胰酶粉及胰激肽释放酶粗品中提取纯化而得。经过多年发展，胰激肽释放酶提取纯化方法很多，常见的有硫酸铵沉淀法、离子交换层析法、有机溶剂分级、亲和层析法等，但硫酸铵沉淀法溶剂用量大、产品纯度低；离子交换树脂吸附过程复杂、收率低；有机溶剂分级由于要耗用大量有机溶剂，成本高，效益低。

目前，国际上基于胰激肽释放酶的纯化研究大多采用阴离子交换(通常为DEAE配基)结合阳离子交换(通常为CM配基)，最后加一步凝胶过滤层析，并且离子交换过程中胰激肽释放酶洗脱都采用改变pH的方式。由于缓冲液的缓冲作用，使柱内pH改变缓慢，周期延长，耗费大量缓冲液。

国内众多科技人员也对胰激肽释放酶进行了研究，在传统工艺上做了很多改进，包括DEAE-纤维素吸附工艺、盐析与疏水色谱相结合工艺、胰激肽原酶、弹性酶和糜胰蛋白酶的联产工艺等，在胰激肽释放酶的产品质量和提取率上有很大提高，但总体工艺仍较落后。

因此，研究开发出一条工艺简单、成本低、效率高的从胰脏中提取胰激肽释放酶的工艺不仅充分利用胰脏资源，且胰激肽释放酶具有多种生理功能，能创造巨大的经济价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一种胰激肽释放酶的制备方法，以畜禽胰腺为原料，采用磁性亲和分离技术，工艺简单，产品酶活可达1100U/mg以上。

磁性亲和分离技术是将亲和色谱的高选择性、高回收率的特点与磁性材料的磁可导向性相结合的一种新的分离技术，可以直接处理浑浊液，现已在蛋白质的分离纯化、固定化酶、免疫测定、靶向药物等方面得到了广泛的应用。琼脂糖被认为几乎拥有理想基质的所有特点，是应用最广泛的亲和分离介质之一；胍基与胰激肽释放酶具有较强的亲和力；环氧氯丙烷(ECH)活化则既可在水溶液中，又可在有机溶剂中进行，操作方便；1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)及其偶联后的产物都溶于水，不仅操作简单，而且酶的活性回收率和纯化倍数均较高。因此，根据磁性亲和分离技术原理及产品的特性，本发明选用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，含胍基乙酸配体的磁性亲和吸附剂，ECH为活化剂，EDC·HCl为偶联试剂，己二胺(DAH)为间隔臂。

本发明制取胰激肽释放酶的步骤如下：

1.粗胰激肽释放酶的制备

称取一定量的畜禽胰腺，高速组织捣碎机处理，在pH5.5条件下，添加2-5倍原料量的预冷的25％乙醇和3-6％原料量的CaCl₂，搅拌制取粗胰激肽释放酶，搅拌速度为60～90r/min，20℃下提取2-3h，之后过滤。

2.磁性亲和分离

采用以磁性琼脂糖微球(MAMS)为基质，胍基乙酸为配体的磁性亲和吸附剂，环氧氯丙烷(ECH)为活化剂，1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)为偶联试剂，己二胺(DAH)为间隔臂。纯化时在一定量胰激肽释放酶粗品中加入0.02-0.05mol/L PBS，0.1-0.3mol/L NaCl，0.01-0.03g/L Tween-80(pH7.2)的缓冲溶液，然后加入磁性亲和吸附剂，缓慢搅拌1-2h，用磁铁将吸附剂吸附在容器侧壁上，倾去上清液及未被磁场吸附的不溶物，用上述缓冲溶液洗涤3次，然后用0.1mol/L NaOAc，0.4mol/L NaCl，0.01g/L Tween-80(pH4.0)溶液洗脱。

3.超滤浓缩

采用截留分子量为10000Da的超滤膜浓缩洗脱液。

4.冷冻干燥

将浓缩后的洗脱液经预冻、低温升华、高温干燥3个阶段进行冷冻干燥，得优质胰激肽释放酶。

附图说明

附图1是以畜禽胰腺为原料，经高速组织捣碎机处理、粗提、磁性亲和分离、超滤浓缩、冷冻干燥等工艺步骤，得到胰激肽释放酶的工艺流程图。

具体实施方式

提出以下实例用于说明本发明，但本发明的内容并不局限于此。

实施例1