[发明专利]一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法

说明书

本发明提供了一种抗人源多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法，属于抗体及其制备领域；本发明为取多药耐药性大肠癌病理组织总RNA并逆转录为cDNA，利用本实验室设计的特异性引物扩增出P‑gp跨膜区（氨基酸784～968）基因片段，克隆至pET28a（+）载体并转化E.coli BL21（DE3），IPTG，30℃诱导表达，表达产物经镍离子亲和层析柱纯化后Western Blot鉴定。将纯化的P‑gp_784‑968蛋白作为抗原，对利用17条重链上游引物和5条重链下游引物；20条轻链上游引物及2条轻链下游引物，用原核表达的P‑gp_784‑968肽段对 pComb3载体的P‑gp Fab抗体库进行五轮淘选，最终淘选所获得的克隆进行双酶切鉴定及IPTG诱导表达，表达产物通过ELISA及Western Blot鉴定后获得阳性克隆菌株，并测序，得PFab29。本发明为制备抑制肿瘤多药耐药的药物提供可能。

技术领域

本发明属于Fab抗体及其制备领域，特别涉及一种抗多药耐药蛋白Fab抗体及其制备方法。

背景技术

肿瘤细胞的多药耐药性(multi-drug resistance，MDR)多为获得性耐药，即在治疗前对药物敏感，治疗后对药物耐受。多药耐药性是指不仅对使用药物产生耐受，而且对其他多种结构和作用机制完全不同的药物产生交叉耐受。肿瘤细胞产生多药耐药性的最主要原因是瘤细胞膜过量表达一种ATP依赖性外排性泵，以减少化疗药物在细胞内部的积累。这种ATP依赖性外排性泵属于ABC(ATP-binding cassette)转运蛋白超家族，主要包括以下几种：(1)肿瘤多药耐药蛋白1/P-糖蛋白即为P-gp(Multi-Drug Resistance1/ P-glycoprotein，MDR1/P-gp)也称为ABCB1(ATP-binding cassette B1)，它是1976年Juliano等在耐药的中国仓鼠卵巢癌细胞中发现的，随后Roninson等获得人耐药KB癌细胞株的MDR1基因序列^[1]，P-gp也是现在引起肿瘤多药耐药性最常见的原因。(2)多药耐药相关蛋白(3)乳癌耐药蛋白(Breast cancer resistance protein，BCRP)(4)肺耐药相关蛋白(Lungresistance related protein，LRP)。

P-gp是引起肿瘤细胞多药耐药性的最主要原因，由多药耐药蛋白基因1(multi-drug resistance1，mdr1)编码为两个完全相同的单体组成，每个单体含有一个七次跨膜疏水区和一个ATP结合区，两个单体组合成一个能量依赖性泵位于细胞膜上。P-gp在分解ATP供给能量的同时，可以将肿瘤细胞内部的亲脂性化学药物排到细胞外，因此一些亲脂性药物可以竞争性抑制P-gp外排化疗药物的功能。P-gp诱导的多药耐药肿瘤中同时检测到高水平的蛋白激酶C(Protein Kinase C，PKC)，PKC主要通过磷酸化P-gp药物结合位点的丝氨酸而增强其外排化疗药物的功能。

第一代P-gp抑制剂为亲脂性化合物，如维拉帕米、奎尼丁、环孢素A等，可作为P-gp底物，与化疗药物竞争性或非竞争性结合P-gp，从而减少化疗药物外排。但是当它们的应用剂量达到抑制P-gp功能时有很强的毒副作用，这也限制了它们的临床应用。接着第二代P-gp抑制剂出现，如PSC-833(环孢素D衍生物)和Biricodar，它们与P-gp的亲和力更强，并且没有免疫抑制副作用；但是它们缺乏特异性，同样抑制正常组织P-gp功能，而且还抑制细胞色素P450 3A的功能进而影响药物代谢，因此它们的研发也受到限制。于是以tariquidar、OC144-093、zosuquidar、elacridar为代表的第三代P-gp抑制药物应运而生，它们对P-gp亲和力高，而且对依赖细胞色素P450 3A的药物代谢影响很小，然而它们在达到抑制P-gp功能剂量时，仍有一定的细胞毒性，目前tariquidar、zosuquidar等第三代P-gp抑制药物还处于临床试验阶段。