[发明专利]一种蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法

权利要求书

1.一种蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

（1）将玻碳电极预处理后，取质量百分比浓度为0.5%的壳聚糖溶液滴满处理后的玻碳电极表面，于45℃干燥3h使所述壳聚糖溶液形成包住玻碳电极的凝胶；

（2）干燥后自然冷却至室温，再浸于浓度为1mo l/L的NaOH溶液中5min，用超纯水清洗掉NaOH溶液，之后浸于超纯水中30min使NaOH离子彻底进入水中；

（3）取出自然晾干后置于纳米金溶胶中至少24h，得到纳米金电极；

（4）将步骤（3）得到的纳米金电极置于纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中4℃自组装至少24h，即得单层纳米金修饰电极；

（5）再取硫堇/壳聚糖共聚物溶液滴加于上述单层纳米金修饰电极表面的中心，自然干燥后形成聚合物膜，用超纯水反复清洗所形成的聚合物膜至洗出水在600nm下无吸光值；然后置于纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4℃自组装至少24h，之后，超纯水冲洗后再置于纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体中4℃自组装至少24h，最后置于浓度为1g/100mL的牛血清白蛋白溶液中37℃温育至少1h，以封闭非特异性位点，以含体积百分比为0.05%Tween-20的磷酸缓冲液清洗未结合的牛血清白蛋白，自然晾干即得双层纳米金修饰的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器。

2.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述玻碳电极预处理包括下述过程：将玻碳电极依次分别用1.0μm、0.3μm、0.05μm粒径的α-Al₂O₃浆在麂皮上抛光三次，且每次抛光后在超声水浴中清洗30s，最后依次用HNO₃与H₂O按照体积比为1∶1配置的混合液、无水乙醇、超纯水清洗；在1mol/L H₂SO₄溶液中用扫描范围为1.0～－1.0V、扫描速度为100mV/s的循环伏安法活化电极，重复扫描直至出现稳定的循环伏安曲线。

3.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述纳米金溶胶通过下述方法得到:

①制备纳米金所用的玻璃器皿先用新配制的王水浸泡72h，取出后用水冲洗掉残留的酸液，再用蒸馏水浸泡24h，取出干燥后用含体积百分比为5%二氯二甲基硅烷的三氯甲烷溶液进行硅化，之后用超纯水充分冲洗，烘干备用；

②根据Frens法取浓度为0.01g/100mL的氯金酸溶液100mL，加入浓度为1g/100mL的柠檬酸钠溶液4mL混匀，用HC l或K₂CO₃调节反应液pH值至7.0，置于微波炉中低火保持18min，自然冷却后用超纯水补充至104mL即得纳米金溶胶，置于4℃避光保存备用。

4.根据权利要求1或3所述的乳源蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述纳米金/辣根过氧化物酶溶液采用下述方法制备：用0.1M K₂CO₃调节所述纳米金溶胶的pH值至7.0后，取1mL上述pH值为7.0的纳米金溶胶与1mL 2.0g/L辣根过氧化物酶溶液搅拌2h混匀，4℃静置过夜。

5.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述硫堇/壳聚糖共聚物溶液通过下述方法制备：将2.5mL质量体积百分比为2%的壳聚糖溶液加到320μL体积百分比为10%的戊二醛溶液中，混匀后加入0.01M硫堇溶液200μL，最后加入体积百分比为2%的醋酸溶液至总体积为6mL，混匀后即可用于滴涂电极。

6.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述纯化的蜡样芽孢杆菌单克隆抗体通过下述方法制备：蜡样芽孢杆菌单克隆抗体腹水，采用蛋白A进行亲和层析纯化；腹水效价为1∶102400，抗体亚型为IgG1，对苏云金芽孢杆菌1.1014、蕈状芽孢杆菌1.0856、巨大芽孢杆菌1.0151均无交叉反应。

7.根据权利要求3所述的蜡样芽孢杆菌电化学纳米免疫传感器的制备方法，其特征在于，所述王水由浓HCl与浓HNO₃按照体积比为3∶1的比例配置而成。