[发明专利]用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）疫苗的重组蛋白HF2及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌alpha溶血素无毒突变体与纤连蛋白结合蛋白A活性片段的重组蛋白HF2，本发明进一步涉及该重组蛋白的制备方法及其在制备疫苗和检测试剂盒中的应用。 

背景技术

金黄色葡萄球菌能导致人体产生广泛的疾病，如菌血症，心内膜炎，毛囊炎，疔，疖，痈，脓疱病，蜂窝(组)织炎，葡萄状菌病，毒性休克综合症，中枢系统感染，感染性眼部炎性疾病，骨髓炎，骨及关节感染，呼吸系统感染等，给人类健康带来极大的威胁。而由于该菌的多重抗生素耐药性使得局面更加难以控制，治疗手段的选择越来越少。 

免疫学手段被寄以厚望用以控制金黄色葡萄球菌尤其耐甲氧西林金黄色葡萄球的感染及传播。免疫策略可以分为主动免疫与被动免疫，被动免疫用靶向金黄色葡萄球菌的抗体进行，主动免疫通过选择合适的抗原促使机体产生免疫反应。合适的多糖及多肽都可以作为抗原构成疫苗的有效组分。如多糖CP5，CP8被Nabi公司用作疫苗组分；蛋白IsdB被Merck公司用作疫苗组分。 

Hla是一个在大多数临床分离株上都表达的穿孔形成毒素。它与多种疾病有关如肺炎，败血症关节炎及脑脓疮等。Hla单体约33kDa，以七聚体形式发挥功能，每个单体的第110-150氨基酸互相靠拢在磷脂双分子层上形成孔。随后导致细胞膜破坏，胞内离子渗出等。其毒性很强，在很低浓度情况下即可致病。因此，诱导机体产生高效抗Hla抗体应是控制金黄色葡萄球菌感染的一个重要方面。我们在此发明中将突变后无毒的Hla（H35L）作为疫苗的候选组分之一。 

纤维连接蛋白结合蛋白（FNBA）是一表面相关多功能受体，特异可逆结合 于人纤维连接蛋白，fibrin,fibrinogen等。该结合在机体手术及受伤情况下使细菌有效粘附，随之侵入定植。FNBP为一929个氨基酸约106kDa的酸性蛋白。诱导机体产生其抗体可以阻止SA粘附于人组织，进而阻止感染。由于FNBA分子量大，难于用重组工程菌进行完整蛋白的表达，我们将FNBA成熟肽第464-904氨基酸作为候选疫苗之一。 

发明内容

针对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的高耐药性，本发明提供一种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌alpha溶血素无毒突变体与纤连蛋白结合蛋白A活性片段的重组融合重组蛋白，其可应用于制备抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的亚单位疫苗以及相关的检测试剂盒。本发明采用基因工程技术重组表达所述融合蛋白，不仅表达量高便于分离纯化而且高效安全。动物试验证明可有效刺激机体产生较高的体液免疫应答和良好的免疫保护作用。 

重组融合蛋白由金黄色葡萄球菌alpha溶血素（Hla）与纤维连接蛋白结合蛋白(FNBA)片段组成，其中，Hla与FNBA通过连接肽融合。所述重组融合蛋白具有Hla-Linker-FNBA的结构特点，简称HF2；具有SEQ ID NO:1的DNA序列及SEQ ID NO:2的氨基酸序列。 

所述连接肽为Linker，该连接肽为-(Linker)n-，其中Linker为GGGGS或GGSGG或YAPVDV，n为1-4，优选Linker为GGGGS，n为1。 

所述Hla为第110-150缺失的突变体Hla(delta 110-150)及Hla(H35L,delta110-150)的金黄色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla。 

所述Hla优选第110-150缺失的突变体Hla(H35L,delta110-150)的金黄色葡萄球菌alpha溶血素全毒素Hla，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。 

所述FNBA为金黄色葡萄球菌纤维连接蛋白结合蛋白膜外区，具体地指金黄色葡萄球菌纤维连接蛋白结合蛋白膜外区，其氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。 

上述的重组融合蛋白的制备方法蛋白，包括以下步骤： 

1）全基因合成以获得编码Hla(H35L delta110-150)的DNA序列； 

2）用核酸序列如SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:8所示的正向和反向引物，扩增出重组融合蛋白的Hla部分； 

3）用核酸序列如DNA序列为SEQ ID NO:9及SEQ ID NO:10所示的正向和反向引物，从MRSA基因组扩增出重组融合蛋白的FNBA部分； 

4）以Hla及FNBA做模板，用核酸序列如SEQ ID NO:7及SEQ ID NO:10所示的正向和反向引物扩增出重组融合蛋白HF2片段；