[发明专利]一株基因改性的高效解磷工程菌及其应用

权利要求书

1.一株基因改性的高效解磷工程菌，为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H 1CGMCC No.6089。

2.根据权利要求1所述的高效解磷工程菌，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1CGMCC No.6089是革兰氏阳性杆菌，顶端生芽孢；在YPD培养基上生长良好，48h形成直径2-3mm大小的圆形菌落，有运动性，好氧，菌落呈白色有光泽，表面湿润、平坦，边缘整齐；生长温度范围：25℃-37℃，最适生长温度：30℃-37℃；生长酸碱度范围：pH 2-9，最适pH值为7.0。

3.一种高效解磷微生物菌剂，其活性成分为权利要求1或2所述的解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089的发酵液或发酵液干燥得到的固体菌剂。

4.根据权利要求5所述高效解磷微生物菌剂，其特征在于，为所述发酵液与草炭、轻质碳酸钙经混合、粉碎得到的，三者混合比例为1:3-5:0.03-0.05，优选1:4:0.04（重量比）。

5.一种构建权利要求1或2或3或4所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089的方法，包括以下步骤：

1）选定一株能解磷的芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57，其16S rDNA序列如序列表中序列1所示；

2）在序列表中序列2所示的葡萄糖脱氢酶基因(gdh)的5’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因启动子（PsubE），在3’端添加枯草杆菌蛋白酶E基因转录终止子（TsubE），得到序列表中序列3所示的葡萄糖脱氢酶基因的完整表达元件，然后将其克隆到芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭质粒pHY300PLK的BamH I和Sal I酶切位点之间，得到携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH；

3）将携带葡萄糖脱氢酶基因完整表达元件的芽孢杆菌表达载体pHYH通过电击转化方法导入芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefacien3）PS57中，得到基因改造的高效解磷工程菌即解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089。

6.一种得到权利要求3或4所述解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57 CGMCC No.6089的发酵液的方法，包括以下步骤：

1）配制无机磷细菌液体培养基，配方为：葡萄糖10g，硫酸铵0.5g，酵母粉0.5g，氯化钠0.3g，氯化钾0.3g，硫酸镁0.3g，硫酸亚铁0.03g，硫酸锰0.03g，磷酸钙5g，蒸馏水1000mL，pH 7.0-7.5，将培养基在使用前用常规方法115℃灭菌30min；

2）将解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089按5％的比例接种于步骤1）的无机磷细菌液体培养基中，在摇瓶转速180-200r/min下培养20-24h，得到PS57H1发酵液。

7.一种制备权利要求4所述高效解磷微生物菌剂的方法，将权利要求6所述PS57H1发酵液与高温灭菌后的草炭、轻质碳酸钙按照1:4:0.04（重量比）的比例在搅拌机内搅拌均匀，粉碎后得到。

8.一种活化磷肥，其特征在于，包括磷肥和按磷肥质量的1-50％添加的权利要求3或4所述高效解磷微生物菌剂。

9.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）PS57H1 CGMCC No.6089在溶解土壤难溶磷中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述土壤难溶磷为包括磷酸钙、磷灰石和磷铁矿中的磷酸三钙等的无机磷。