[发明专利]超级细菌NDM和KPC基因双重荧光定量PCR检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及荧光定量PCR技术领域，特别涉及检测超级细菌耐药基因的双重荧光定量PCR技术及其试剂盒。

背景技术

碳青霉烯是有着广谱抗菌活性的一类β-内酰胺类抗生素，常作为治疗高产Ampc和超广谱的β-内酰胺酶的革兰阴性杆菌引起的感染的最有效的药物。但随着碳青霉烯类抗生素的广泛使用，细菌也逐渐获得对此类药物的耐药性。近年来，耐碳青霉烯的非发酵菌已成为医院感染的严重问题，而且耐碳青霉烯的肠杆菌细菌的报道也越来越多，这种耐碳青霉烯的革兰阴性杆菌的快速传播和流行正日益成为令人担忧的全球性问题。

细菌对碳青霉烯类抗生素耐药主要原因是产生碳青霉烯酶，其包括Ambler分子分类的A、B、D三类酶。其中A类中的新增成员KPC（Klebsiella Pneumoniae Carbapenemase）和B类中新增成员NDM（New Delhi metallo-β-lactamase），因其能够水解除头霉素类以外几乎所有的β-内酰胺类抗菌药物而引起了世界各国抗感染专家和临床微生物工作者的极大关注。携带有NDM或KPC基因的细菌也被称为“超级细菌”。 特别是携带有NDM的“超级细菌”目前仅对替加环素和黏菌素敏感，但是前者具有毒副作用，后者只能用于治疗部分种类的细菌感染，一般不适合大规模使用而且对黏菌素耐药的多重耐药菌株目前已有报道。由NDM或KPC型的“超级细菌’感染造成的暴发流行，往往使治疗陷入无药可用的境地，给临床抗感染治疗带来极大挑战。因此及时检测NDM和KPC基因，对细菌耐药表型进行监测，控制和杜绝超级细菌的爆发流行显得至关重要。

目前主要利用分子生物学技术检测携带NDM或KPC基因的超级细菌，PCR的方法更是被誉为检测的“金标准”。但普通PCR容易产生非特异性扩增，甚至会因为操作的原因出现假阳性或假阴性，而且普通PCR的结果判断需要对产物进行凝胶电泳分析，操作不够简化。目前尚缺乏一种灵敏度高、特异性好、操作简便，且能对同时对KPC和NDM基因进行联合检测的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种超级细菌NDM和KPC基因双重荧光定量PCR检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测方法，包括以下步骤：

（1）提取待检样本的DNA模板；

（2）对DNA模板进行PCR扩增，所用引物和探针序列如下：

NDM基因上游引物NDM-F：TTGGCGATCTGGTTTTCC（SEQ ID NO.1），

NDM基因下游引物NDM-R：GGTTGATCTCCTGCTTGA（SEQ ID NO.2），

NDM基因的探针NDM-probe：TGGCAGCACACTTCCTATCTCG（SEQ ID NO.3），

KPC基因上游引物KPC-F：CGCAACTGTAAGTTACCG（SEQ ID NO.4），

KPC基因下游引物KPC-R：CATGCCTGTTGTCAGATA（SEQ ID NO.5），

KPC基因的探针KPC-probe：CCACTGTGCAGCTCATTCAAGG （SEQ ID NO.6）；

所用探针标记的荧光基团互不相同；

（3）结果分析：反应结束，根据待测样本的Ct值判断其是否为NDM、KPC基因阳性。

上述双重荧光定量PCR扩增体系为：10μl 的Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2×)，10μmol/L的NDM和KPC上下游上下游引物各0.4μl，5μmol/L的NDM-probe和KPC-probe各0.2μl， ROX Reference Dye II 0.4μl，待检DNA模板或阳性对照DNA或阴性对照1μl，加灭菌去离子水补足体积至20μl。

上述双重荧光定量PCR反应条件为：95℃预变性20s；然后95℃ 3s，60℃ 30s，反应40个循环。

上述探针标记荧光为：JOE-ECLIPSE和FAM-ECLIPSE。

所用荧光定量PCR仪为美国ABI 7500 FAST。

一种超级细菌的双重荧光定量PCR检测试剂盒，包括如下成分：Premix Ex Taq (Probe qPCR) (2×)、引物、探针、ROX Reference Dye II、阳性对照品、阴性对照品，其中引物和探针序列分别为：

NDM基因上游引物NDM-F：TTGGCGATCTGGTTTTCC（SEQ ID NO.1），