[发明专利]水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法

说明书

技术领域：

本发明涉及一种水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法及其在农业上的应用，属于农业科学技术领域。

背景技术：

水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streaked dwarf virus，RBSDV)属于呼肠孤病毒科(Reovirdae)斐济病毒属(Fijivirus)，是一种由灰飞虱以持久性不经卵方式传播的病毒，主要侵染玉米引发玉米粗缩病和侵染水稻引发水稻黑条矮缩病，感病植株表现为植株生长受严重抑制矮缩，叶色浓绿，叶片、叶鞘及茎杆上可出现蜡滴状突起，水稻上后期可形成黑条斑，玉米叶背面有明显的粗糙感，重病株不抽穗或散粉不良，严重影响玉米、水稻产量。目前RBSDV主要分布于中国、朝鲜、韩国和日本等东亚国家及地区，我国玉米上1954年在新疆南部和甘肃西部首次发现、水稻上1963年在浙江省余姚县首次发生，后长期在华北、西北、华中、华东等地的玉米上、上世纪90年代主要在浙江中南部的籼稻上常年发生危害，并间断性爆发。水稻上2007年以来在江苏、山东各地呈暴发流行态势，目前该病在安徽、江西以及福建北部在内的长江流域中东部均有分布，对水稻生产造成了巨大经济损失。据江苏省植保站数据统计，2007年RBSDV引起的水稻黑条矮缩病在江苏盐城、连云港、泰州、淮安、扬州和徐州等地严重发生，当年发生危害的面积达2.05万hm²，2008年发展到2.67万hm²，绝收田块达2000hm²，2009年持续增长至33.3万hm²，严重影响了江苏等地水稻的安全生产。玉米上2005年以来在河北、山东、山西、江苏等省的夏玉米区特别是套播或晚春播、早夏播玉米发生危害严重。据统计，2008年山东省发生面积达73.3万hm²，绝产1.67万hm²；大连市大面积发生，重病田块发病率达60％-80％，玉米粗缩病成为该区玉米上的重要病害。

病毒病的防治最为理想的方法是选育和利用抗病品种，这一工作的开展需要建立科学的抗性鉴定方法。由于RBSDV等由昆虫作为媒介的特殊传播方式，不能使用病汁液摩擦进行直接接种。研究者多采用在病株上饲喂方式获得携带RBSDV的灰飞虱进行病毒的接种，而罹病植株往往长势较差或受环境影响较大难以长期保存，病株在采集后需尽快饲毒，极大地限制了研究时间。另有报道可使灰飞虱从冷冻病株中获得RBSDV，但其获取带毒灰飞虱的效率与可操作性以及短期内获得大量带毒灰飞虱的可行性还有待进一步检验，且每次均需病株作为毒源。以上所述种种因素给围绕RBSDV开展的抗病品种选育工作和需要RBSDV活体材料进行各方面研究的工作带来了很大的难度。为解决这一技术瓶颈，发明人从田间小麦易感染RBSDV而普遍发生水稻黑条矮缩病的现象中得到启发，研究了一种在实验室内可长期活体保存RBSDV的方法，通过多次验证及连续循环试验证明这一方法可常年不间断获得大量高带毒率灰飞虱，可为水稻抗黑条矮缩病和玉米抗粗缩病的品种选育、病毒提纯和血清制备、病毒致病性及其分子机理研究等提供基本的材料和技术手段。

发明内容：

本发明提供了一种水稻黑条矮缩病毒室内活体保存方法。

本发明的原理是以小麦作为毒源寄主，让携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱成虫在小麦幼苗上传毒、后代灰飞虱若虫从小麦上获毒，从而可以在室内饲养条件下短期内获得大量带毒灰飞虱。

在上述方法中“携带水稻黑条矮缩病毒的灰飞虱成虫”初次是通过以下手段获得的。从田间采集的具有植株显著矮缩、平行于叶脉的短条状叶片皱折和白色蜡滴状突起等水稻黑条矮缩病或小麦绿矮病症状的新鲜植株，应用分子方法检测其携带水稻黑条矮缩病毒而不携带水稻条纹病毒，利用刚孵化的无毒灰飞虱若虫饲喂48h后移入健康水稻苗上过循回期，待灰飞虱长至4-5龄时，取出50头灰飞虱应用免疫学方法检测其携带水稻黑条矮缩病毒的带毒率。后期此带毒灰飞虱成虫可用本试验方法获得。

在上述方法中，带毒灰飞虱的有效接种虫量为4-6头/株。

所述用于接种灰飞虱的麦苗需用清水浸种24h，催芽48h，待麦种出现白色芽后播于1000ml烧杯中，每杯播15粒有效麦种，待麦苗长至2-4叶期时可用于接种。

所述孵化的灰飞虱在麦苗上的时间为15-20天，可根据麦苗实际生长状况，按常规方式管理尽量控制其不低于15天，待麦苗长势较弱时将灰飞虱移入健康水稻苗上过循回期。

所述为增加麦苗上孵化灰飞虱的数量，在接完有毒灰飞虱后以5头琳的虫量接入刚羽化无毒灰飞虱雌虫用于产卵，产卵时间为36h-48h。