[发明专利]发酵－酶解－提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生化物质转化提取技术领域，具体涉及一种发酵－酶解－提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法。 

背景技术

柑橘是世界第一大水果，我国柑橘种植面积和产量均位居世界第一。橙皮苷是柑橘中的主要黄酮，由于橙皮苷的水溶性和吸收性较差，表现出的药理作用相对较弱。通过化学法或酶法将橙皮苷脱去一分子的鼠李糖苷，生成橙皮素单葡萄糖苷可提高其水溶性，有效增强其功效，目前橙皮素单葡萄糖苷市场价格高达1000元/kg以上。但化学法的水解反应条件难以掌握。目前有报道通过橙皮苷酶降解橙皮苷生成橙皮素单葡萄糖苷，橙皮苷酶是由α-鼠李糖苷酶和β-葡萄糖苷酶组成的复合酶，但该复合酶不仅能将橙皮苷转化为橙皮素单葡萄糖苷，而且又能进一步将橙皮素单葡萄糖苷降解为橙皮素，而橙皮素的水溶性比橙皮素单葡萄糖苷低，故其生物活性的有效利用率也明显降低。因此，该直接酶解方法不仅存在有橙皮素单葡萄糖苷得率较低，同时，该橙皮苷酶目前的价格较昂贵，还无法用于工业化生产。 

发明内容

本发明目的是，针对现有利用橙皮苷酶酶解橙皮苷制备橙皮素单葡萄糖苷方法存在有得率低、易被降解，且橙皮苷酶价格较高等的问题，提出一种得率高，且既能降低生产成本，又能防止生成的橙皮素单葡萄糖苷进一步降解为橙皮素的发酵－酶解－提取耦联制备橙皮素单葡萄糖苷的方法。 

  

一种用于橙皮苷发酵，高效提取、制备橙皮素单葡萄糖苷菌株的选育，鉴定及其生物学特性与保藏：

（1）菌种的初筛：

菌种于2011年7月取样于浙江省衢州市橙皮苷生产工厂的柑橘幼果原料中。

称取原料样品2.0 g加入20 ml无菌生理盐水中，振荡10 min后静置分层，取上层悬液10倍比稀释，将梯度稀释为10^-1、1^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6的菌液涂布于分离培养基上于30 ℃培养4 d后，从该分离培养基上挑取单菌落，再接种于橙皮苷筛选培养基上，于30℃培养4 d后依据透明圈的大小，从中筛选获得14株菌株；将所得的菌株分别保存在保存培养基试管斜面上，培养72小时后，将菌种分别保存于4 ℃冰箱中，并每3周活化一次；其中的， 

分离培养基为：葡萄糖30 g，牛肉膏1 g，K₂HPO₄·3H₂O 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，蒸馏水1000 mL， pH自然；

橙皮苷筛选培养基为：牛肉膏1 g，K₂HPO₄·3H₂O 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，蒸馏水1000 mL，橙皮苷1 g，琼脂15 g，pH自然；

保存培养基为：葡萄糖30 g，牛肉膏1 g，K₂HPO₄·3H₂O 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，蒸馏水1000 mL，琼脂15 g，pH自然；

（2）菌种的复筛：

将上述的保存菌种挑取少量，分别接种于发酵培养基中，在30 ℃、160 rpm旋转摇床上培养4天，分别取发酵液，测定液中还原糖和橙皮素单葡萄糖苷的含量；检测结果表明，菌株HESPER能够产生橙皮素单葡萄糖苷酶，并能产生橙皮素单葡萄糖苷，且传代稳定性好；其中，

发酵培养基为：牛肉膏1 g，K₂HPO₄·3H₂O 1 g，MgSO₄·7H₂O 0.5 g，FeSO₄·7H₂O 0.01 g，蒸馏水1000 mL，橙皮苷1 g，pH自然；

（3）菌株HESPER生物学特征鉴定：