[发明专利]利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法

权利要求书

1.一种利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以携带第一抗性基因的质粒为模板，进行PCR扩增，获得第一抗性基因片段；

其中，PCR扩增引物的5’端设计成与需要进行重组的基因序列同源的序列，PCR扩增引物的3’端设计成与需要扩增的抗性基因两侧同源的序列，使扩增获得的DNA中间为第一抗性基因，第一抗性基因的两侧连接有用于进行基因重组的短的同源序列；

2）将扩增的第一抗性基因片段与克隆质粒连接后，将连接产物转化至大肠杆菌中，经筛选，得到阳性克隆质粒；

3）以步骤2）的克隆质粒上的克隆位点上下游序列作为保护序列，设计PCR扩增引物，并以步骤2）得到的阳性克隆质粒为模板，进行PCR扩增，得到用于敲除目的基因的同源重组DNA片段，该同源重组DNA片段中间为抗性基因，抗性基因两侧是短同源臂，短同源臂两侧是来源于克隆质粒上的序列；

4）将步骤3）获得的同源重组DNA片段，电击转化至含有pDK6-red质粒的克雷伯氏肺炎杆菌感受态细胞内；

5）将步骤4）的转化后的克雷伯氏肺炎杆菌细胞进行培养，抗性筛选获得阳性重组子，从而获得基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，携带第一抗性基因的质粒包括：携带安谱霉素抗性的质粒，携带链霉素抗性的质粒，携带四环素抗性的质粒，或携带氯霉素抗性的质粒。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤1）中，短的同源序列是指设计在PCR引物上的、与需要进行重组的目的基因同源的序列，长度在39到50碱基。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤3）中，保护序列是任意的DNA序列。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述保护序列是长度为200-2000碱基对的保护序列。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：所述保护序列是长度为400-700碱基对的保护序列。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于：还包括：步骤5）获得的基因重组的克雷伯氏肺炎杆菌细胞，通过利用携带第N抗性基因的质粒，重新按照步骤1）～5）进行操作，制备同时携带第N抗性基因的同源重组DNA片段，以进行第二次或多于两次的基因重组操作；

其中，携带第N抗性基因的质粒中，N是大于或等于2的整数，且第N抗性基因不同于第一抗性基因；该携带第N抗性基因的质粒包括：携带氯霉素抗性的质粒、携带四环素抗性的质粒、携带链霉素抗性的质粒或携带安普霉素抗性的质粒。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述利用短同源序列进行克雷伯氏肺炎杆菌基因重组的方法中，当需要重组后将抗性基因消除时，在步骤1）中加入如下步骤：

在抗性基因的两端添加如SEQ ID NO.1所示的FRT序列。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤5）中的阳性重组子，能通过卡那霉素筛选质粒pDK6-red丢失的克雷伯氏肺炎杆菌的菌株，然后，转进pDK6-flp质粒来消除插入染色体的两端连接FRT序列的抗性基因，获得消除抗性标记的菌株；

其中，该消除抗性标记的菌株，再通过卡那霉素筛选丢失质粒pDK6-flp的菌株后，再转进质粒pDK6-red后，能按照如权利要求1所述的方法，重新进行基因同源重组操作。