[发明专利]具有免疫抑制作用的天花粉蛋白有效表位肽段及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一组中药天花粉蛋白有效表位肽段及其抑制作用。

背景技术

天花粉蛋白（Trichosanthin,Tk）是从中药栝楼（Trichothansus kirilowii Max）块根中提取的植物蛋白。我国上世纪60年代起获得结晶纯的Tk制剂并大量用于临床中期引产。后发现Tk还具有多种生物学功能，包括抗肿瘤、诱导细胞凋亡、抗病毒（包括艾滋病毒）增殖，和诱导免疫抑制等。

有关天花粉蛋白的分离和制备技术，以往主要是从栝楼块根中对该植物蛋白全长分子进行提取和纯化。有关技术由中科院上海有机化学研究所发展并提供，由上海金山制药厂用于批量制备和生产。其技术要点为榨取新鲜天花粉块根原汁，在酸性条件下（pH 4.0）用丙酮分级沉淀，通过pH 8.6的巴比妥缓冲液透析，制备结晶天花粉蛋白后，从电荷性质、免疫沉淀、N末端氨基酸测定等鉴定纯度，并确定其物理化学特性。

天花粉蛋白作为一种临床应用药物，其缺点目前已不在纯化技术本身，而在于自身的生物学特点，即除了显示治疗效应，尚具有明显的副作用。包括：①过敏反应，早期曾有注射Tk制剂因过敏反应致死的病例。现已通过提高制剂纯度和用前作皮试剔除过敏者避免此类负作用。②毒性反应。包括作为核糖体灭活蛋白所表现的细胞毒性和体内应用所产生的神经毒性。上世纪80年代Tk曾用于治疗艾滋病，因严重神经毒性作用而被美国FDA禁用。

据此，保留天花粉蛋白的治疗效果，包括诱导免疫抑制和抗病毒增殖，而去除其过敏和毒性作用，构成了该中药制剂构效关系研究的主要方面，也是研发本制剂的主要目的。

因而，单纯制备和纯化Tk全分子的技术已不能满足应用和治疗上的需要，因为全分子作为药物，毒性太大。第二方面关于采用化学药物裂解Tk以获取相应肽段的技术也已不再应用，主要缺点，一是药物的裂解点恒定，如果裂解点位于抗原表位中，有可能破坏表位的完整结构，无法显示其生物学功能；二是裂解条件较难掌握，纯度难以达标。

发明内容

本发明的目的在于采用新的技术从天花粉蛋白获取有效表位肽段，既保留其抑制活性，又去除其毒性作用：

（1）提供高效低毒的天花粉蛋白有效表位肽段；

（2）提供该肽段的应用效果。

本发明的目标是通过以下技术和方法来实现的：

（1）用基因工程手段分别表达覆盖Tk全分子并相互重叠的三个Tk片段编码基因，经表达得到相应的三个Tk蛋白质片段F1、F2和F3。纯化后分别测定其细胞毒性和对T细胞的抑制能力，并比较三者的抑制能力。确定Tk分子带有毒性和抑制活性的部分，分别主要在第二（F2）和第三（F3）个片段，F2毒性明显，F3抑制活性最强（图2）。

（2）应用抗原表位分析和生化技术合成基于F3序列的重叠性合成肽PA、PB、PC，PA的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，PB的氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示，PC的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，每条肽包含有40个氨基酸残基。测定各肽段的细胞毒性和抑制活性，筛选低毒强抑制能力的肽段，同时比较在人体细胞和小鼠细胞实验系统中同位素掺入的测定结果，最终得到典型肽段为PA（无毒抑制肽，图3A）。确认低毒和有抑制能力的40肽位于Tk分子的中段和羧基端151－190氨基酸。（制备方法详后）。三种肽的组成为：

PA：LMVLIQSTSEAARYKFIEQQIGKRVDKTFLPSLAIISLEN

PB：YERLQTAAGKIRENIPLGLPALDSAITTLFYYNANSAASA

PC：SWSALSKQIQIASTNNGQFESPVVLINAQNQRVTITNVDA。

（3）同时应用抗原表位分析技术将PA表位分为PAQ、PAR、PAS重叠性肽,各为20肽，同时采用同种异体混合淋巴细胞增殖系统测定其对T细胞增殖的抑制活性，并比较对Tk全长与PA、PAQ免疫抑制能力的差异，结果显示PAQ是最有效的抑制表位（图3B），PAQ的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，PAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，PAS的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。

PAQ：LMVLIQSTSEAARYKFIEQQ

PAR：AARYKFIEQQIGKRVDKTFL

PAS：IGKRVDKTFLPSLAIISLEN。