[发明专利]基因共转染技术建立的白血病小鼠模型及其制备方法

权利要求书

1.一种基因共转染技术建立的白血病小鼠模型的制备方法，包括以下步骤：A、K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒载体的构建

设计K-ras突变引物如下：

K-Ras^G12D正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，

K-Ras^G12D反向引物序列如SEQ ID NO:2所示，

通过PCR扩增目的基因，回收、酶切、连接至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP，进一步完成克隆筛选，测序正确后重新培养含有阳性目的克隆的菌液，提取质粒保存备用；

以Addgene公司购买的AML1-ETO融合基因的质粒为模板，引物设计如下：

AML1-ETO正向引物序列如SEQ ID NO:3所示，

AML1-ETO反向引物序列如SEQ ID NO:4所示，

PCR产生AML1-ETO基因，将扩增的目的基因亚克隆至pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP病毒载体；

B、K-ras突变体及AML1-ETO融合基因慢病毒载体的包装

接种细胞16-20小时后，当细胞接近饱和时进行转染，将293T细胞培养至对数生长期，病毒稀释用培养液为polybrene和2%FBS的细胞培养基。第一天，细胞胰酶消化计数后，按照每孔8000细胞接种96孔板，37℃培养过夜，感染时细胞长至30～50％的融合密度；第二天，当天转染时，将病毒液用含有8ug/ml polybrene和2%FBS的细胞培养液进行梯度稀释，然后小心吸去96孔板中的培养基，轻轻混匀各管慢病毒稀释液，各取100ul加入每孔细胞中，每个稀释度两个重复，放入37℃的细胞培养箱中过夜培养；第三天，去除含慢病毒的培养基，加入100ul的完全培养基；第五、六天，在荧光显微镜下观察各孔中荧光细胞数量，病毒滴度为表达荧光的细胞数乘以相应稀释倍数；

C、骨髓细胞分离及病毒感染情况监测

断颈处死小鼠，游离出小鼠的两条下肢，剥离肌肉，剪去两端软骨，露出红色的骨髓腔，用无菌注射器轻轻插入骨髓腔，对准一个无菌15ml离心管，将细胞冲出，然后离心，去上清；

离心沉淀下来的细胞用PBS冲洗，计数细胞，并计算所需细胞体积数铺板培养并接种于6孔板中，每孔加入K-ras突变体与AML1-ETO融合基因慢病毒的病毒悬液1～2ml，感染8h后离心收集细胞去上清，一部分种于96孔板中加入新鲜培养液继续培养24h，其它部分用于小鼠骨髓移植用，96孔板中的细胞在培养24～48h后用荧光显微镜观察并拍照；

D、感染细胞植入小鼠建立白血病动物模型

取8周的C57小鼠，先服用一周含有抗生素的水后进行8Gy辐照量的处理，辐照后部分小鼠尾静脉注射0.5～1×10⁶小鼠骨髓细胞/只。

2.根据权利要求1所述的基因共转染技术建立的白血病小鼠模型的制备方法制备得到的一种白血病小鼠模型。

3.根据权利要求2所述的一种白血病小鼠模型，其特征在于，该白血病小鼠模型具有以下性能：

A、骨髓细胞分型鉴定：

利用c-KIT，Gr-1，Mic-1的抗体对骨髓细胞进行染色后，应用流式细胞仪分析其各组阳性细胞的比例，从而确定AML的恶性程度，结果显示存在大量GFP⁺/c-Kit⁺/Mac-1^-/Gr-1^-细胞，表明模型小鼠具有AML细胞分化比例的显著表征；

B、分子水平鉴定：

对骨髓细胞进行了QPCR鉴定，实验结果显示，模型小鼠的骨髓细胞中仍然具有前述的外转K-ras基因，这说明K-ras基因具有较高的转录产物；

C、蛋白水平的鉴定：

进一步的Western Blot实验结果证明，以上各种蛋白在模型小鼠骨髓中一直处于高表达状态；

D、外周血细胞分型鉴定：

对外周血中的恶性肿瘤细胞的情况进行分析，结果发现，在外周血的图片中，经过Wright-Giemsa染色后，发现存在许多早幼粒白血病细胞。