[发明专利]一种适合双向电泳的蚯蚓蛋白样品制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种适合双向电泳的蚯蚓蛋白样品制备方法。

技术背景

蚯蚓在生态系统中具有重要的功能，能疏松土壤，增加土壤有机质并改善土壤结构，还能促进酸性或碱性土壤变为中性土壤，增加磷等速效成分，使土壤适于农作物的生长，促进农业增产。蚯蚓是土壤污染的敏感指示物,对多种重金属、有机农药、多氯联苯、多环芳烃、放射性污染物等环境有害物质有反应指示和积累指示的特殊作用。利用蚯蚓的分子、生物化学和生理反应(生物标志物)监测土壤污染情况现已备受关注。目前，国内外利用蚯蚓指示污染物对土壤生态系统造成的影响主要通过实地调查污染土壤中蚯蚓种群数量及种群结构；或是在实验室条件下，通过毒性和繁殖试验研究污染物对某一种类蚯蚓造成的伤害，即蚯蚓的生态毒理学研究。而从分子生物学，尤其是蛋白质组学方面的研究尚且较少。蛋白质组学分析是研究蚯蚓蛋白的自身变化及周围环境刺激响应的重要技术手段。其中双向电泳技术是在蛋白质水平上研究基因表达产物最有效的方法之一。

选择合适的样品制备方法是双向电泳成功的关键因素之一，样品的制备直接影响到分离结果的有效性、可靠性及可重复性。由于蚯蚓中杂质成分复杂，如色素、多糖和核酸等都会严重干扰双向电泳，因此目前还没有制备适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品的分析研究，从而导致蚯蚓相关的蛋白质组研究滞后。

发明内容

为了解决上述问题，本发明利用土壤中的蚯蚓为试材，通过对蛋白质样品制备步骤的大量摸索，建立了一套适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品制备体系，为蚯蚓的蛋白质组学研究提供技术保障。

本发明的技术方案包括以下步骤：

1）取吐泥1d后的蚯蚓于液氮中快速研磨成蚯蚓干粉，研磨时间为5-15min；

2）按蚯蚓干粉质量与以丙酮为溶剂的溶液A的体积之比为1：10的比例，向蚯蚓干粉中加入适量溶液A充分混合，-20℃静置8-12h，得到蚯蚓总蛋白样品；

所述以丙酮为溶剂的溶液A中的溶质为：0.01-0.03mmol/L的二硫苏糖醇、10%（w/v）的三氯乙酸；

3）步骤2）中所得的蚯蚓总蛋白样品离心20-30min：4℃，转速12000-15000g，弃上清液；用-20℃下预冷的以丙酮为溶剂的溶液A洗涤沉淀，-20℃静置1-2h，弃上清液；使用溶液A洗涤沉淀3次以上，直至上清液为无色透明为止,弃上清液，收集沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物；

4）收集沉淀，得到蚯蚓总蛋白粗提物；

5）将步骤4）中得到的蚯蚓总蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液中振荡混合1-2min后冰浴冷却1min,如此重复振荡混合1-2h。裂解缓冲液包括9.8mol/L尿素（urea），4%(w/v)的3-[3-(胆酰氨丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS），65mmol/L二硫苏糖醇(DTT)，2%(v/v)的胶条缓冲液(IPG buffer）,1%(w/v)的苯甲基磺酰氟（PMSF）。所述裂解缓冲液与蚯蚓总蛋白样品的质量体积比为0.04g/400μL-0.05g/400μL；

6）将步骤5）中混合液离心取上清液得到适合双向电泳的蚯蚓总蛋白样品。

使用的样品裂解液中，尿素作为变性剂能破坏蛋白质的高级结构，打断非共价键链接。CHAPS是一种兼性去污剂，能打断蛋白质分子或亚基间的疏水作用，增加蛋白质的溶解性。加入DTT是为了打断二硫键，并使所有蛋白质处于还原状态。PMSF是一种蛋白酶抑制剂，能有效抑制丝氨酸蛋白酶以及巯基蛋白酶的活性，防止目标蛋白的降解。所使用的胶条缓冲液能通过电荷间的相互作用减少蛋白质结合，从而增加蛋白质可溶性。

本发明的有益效果在于采用三氯乙酸-丙酮沉淀蛋白质，并且增加蛋白清洗次数，可以有效去除盐离子、多糖、脂类、核酸等干扰电泳的物质。本发明的方法简单易行，进行双向电泳分析获得了重复性好、分辨率高的电泳图谱。便于后续的质谱分析鉴定，具有较大的实际应用价值。

附图说明

图1为蚯蚓总蛋白样品双向电泳图谱

具体实施方式

以下实例中未详尽描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。应理解以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何形式限制本发明的范围。

实施例1

1.样品制备