[发明专利]一种风疹病毒RT-PCR荧光检测试剂盒及检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种风疹病毒RT-PCR荧光检测试剂盒及检测方法。 

（二）背景技术

风疹是由风疹病毒（Rubella virus，RV）感染引起的急性出疹性呼吸道传染病。妇女在妊娠的前3个月感染RV易引起胎儿先天性风疹综合症（Congenital Rubella Syndromes，CRS），导致流产、死产、胎儿畸形智力低下等。在临床症状上，RV引起的风疹与轻型麻疹以及一些肠道病毒感染所引起的出疹性疾病不易区分。 

因此对于以优生优育为目的的产前诊断或临床诊断来讲，建立快速、敏感、准确的RV检测方法是十分必要的。近年荧光PCR 技术在病毒等微生物检测领域得到广泛的应用，它利用PCR技术对DNA的高效扩增并结合探针技术的高特异性和敏感性，克服了常规血清学和普通PCR方法的不足，是一种很有应用价值的诊断方法。 

（三）发明内容

本发明目的是提供一种风疹感染实验室应急检测的风疹病毒荧光逆转录-聚合酶链反应快速检测试剂盒及方法。 

本发明采用的技术方案是： 

一种风疹病毒RT-PCR荧光检测试剂盒，主要包括RT-PCR反应试剂以及特异性引物和探针，所述特异性引物和探针如下： 

上游引物：5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’ 

下游引物：5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’ 

荧光探针：FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1； 

其中，R为A或G，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团。 

本发明关键在于特异性引物和探针的设计，试剂盒内的其他组分，为本领域常规用于RT-PCR的试剂，如dNTP mix、MgCl₂、buffer、酶等，本领域普通技术人员可根据常识进行选择，可自行配制，也可选用市购商品，如Roche公司的RT-PCR system 1938823试剂盒等。 

本发明还涉及一种利用所述检测试剂盒检测风疹病毒的方法，所述方法包括： 

（1）提取待测样品RNA；所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒，按照试剂盒说明书进行提取。 

（2）以待测样品RNA为模板，加入特异性引物和探针，以及RT-PCR反应试剂，配成RT-PCR反应体系，进行扩增反应； 

所述特异性引物和探针如下： 

上游引物：5’-CCCAGCACTCCACGCAAT-3’ 

下游引物：5’-TCTTTAGGGCCCCACTCRAT-3’ 

荧光探针：FAM-TCGCGGTATACCCGCCGCC-BHQ1； 

其中，R为A或G，FAM为荧光报告基团，BHQ1为荧光淬灭基团； 

（3）荧光RT-PCR检测以Ct值﹤37并且扩增曲线呈S型为阳性判定原则；其中Ct值<35且扩增曲线良好可直接判定为阳性；Ct值在35～37之间需重复实验，两次实验均能得到良好S型扩增曲线方则判定为阳性。 

所述扩增反应的条件为：42℃ 30min进行逆转录，95℃ 2min变性，然后94℃ 10s，60℃ 1min，在60℃进行单点荧光检测，共进行40个循环。 

RV能诱发急性呼吸道疾病，常在托幼机构和中小学校中出现流行或爆发，严重危害青少年健康。传统风疹临床检验常用病毒分离培养法、免疫学方法和普通RT-PCR法等。病毒分离培养由于技术复杂、费时，不适合用于早期快速诊断的需要。免疫学方法虽然操作简便，但其灵敏度较差，且容易出现假阳性和假阴性结果。普通RT-PCR和巢式PCR方法，方法较为简便、敏感，但由于需进行琼脂糖凝胶电泳分析，有容易发生交叉污染的缺点。近年来新发展起来的荧光定量PCR检测技术，具有灵敏度高、检测速度快、特异性强和高通量等优点，已在病原体快速诊断中得到了较广泛的应用。 

国内有建立了荧光RT-PCR检测RV方法，但敏感性仅10³拷贝/μl，相对较低，且探针位点设置在RV的E1基因区域，由于 RV E1基因容易变异常被用于风疹基因的分型，目前变异已达8%～9% 变异，该设计可能存在着实验的不确定性，容易使检测产生假阴性结果。