[发明专利]利用固定化酶合成胆红素的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，具体地说，涉及利用固定化酶促合成胆红素的方法。

背景技术：

胆红素是人胆汁中的主要色素，呈橙黄色。胆红素具备多种药理作用，是制造人工牛黄的主要原料。药理实验证明，它对W256瘤有较好的抑制作用；它对乙型脑炎病毒的灭活率，抑制指数比去氧胆酸和胆酸高1～1.5倍；它还是一种有效的肝脏疾病的治疗药物，在不破坏肝组织的情况下，有增殖新细胞的作用，可治疗血清肝炎、肝硬变等病。此外，胆红素具有镇静、镇惊、解热、降压等作用。主要用于人工牛黄的原料及药品、保健品、化妆品等行业。

牛黄是牛的胆结石，在我国药用已有二千多年历史，是世界上公认的珍贵稀有药料，以牛黄配制的中成药方180多个品种，如日本的救心丹，我国的安宫牛黄丸等。目前市场上的牛黄有天然牛黄、人工合成牛黄及人工培育牛黄。市场上以人工牛黄为主。

人工牛黄的纯胆红素含量只有0.7％。人工牛黄粉胆红素含量太低，远远低于天然牛黄35％的含量标准，功效大打折扣是可想而知的。假定人工牛黄粉胆红素含量按35％的胆红素配制而成本增加不多，则人工牛黄市场会更大。

按常规方法生产胆红素(即以动物如猪胆为材料经化学方法提取)，由于技术门槛太低，毛利润率极低，国内生产企业众多，如四川什邡市康源植物原料有限公司、福建瑞国药业有限公司/哈尔滨瑞国医药有限公司、四川菲德力制药有限公司、安徽科宝生物工程有限公司等。

目前，胆红素是来自胆汁，一公斤胆红素约需5万个猪胆，故胆红素成本较高，因而售价也高。酶催化生产高纯度胆红素之综合成本较低，故经济效益极佳。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种利用固定化酶促合成胆红素的方法。本发明的另一目的还在于提供含有编码本发明所述的血红素加氧酶和胆绿素还原酶的基因序列。本发明的再一目的在于同时利用固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶催化，以血红素和氧气为底物，在氧化型辅酶II辅助下生产胆红素。

为实现本发明的上述目的，本发明人进行了大量深入的实验，通过克隆较佳的血红素加氧酶和胆绿素还原酶的基因至适当的载体，转入大肠杆菌后，本发明的血红素加氧酶和胆绿素还原酶在大肠杆菌中皆高表达。表达的重组蛋白菌体未破菌直接固定化、或破菌后粗蛋白直接固定化、又或破菌后粗蛋白经纯化得纯蛋白再固定化，进而形成固定化酶，并获得了高活力的固定化血红素加氧酶和高活力的固定化胆绿素还原酶，该固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶能以血红素和氧气为底物，在氧化型辅酶II辅助下生产胆红素。

本发明的血红素加氧酶是来源于Clostridium tetani E88。序列表中的SEQ ID NO.：2代表本发明的血红素加氧酶的氨基酸序列。

本发明的胆绿素还原酶是来源于Synechocystis sp.PCC 6803。

序列表中的SEQ ID NO.：4代表本发明的胆绿素还原酶的氨基酸序列。

本发明的酶固定化载体是选择了环氧型载体LX-3000，还可选用本领域的其它酶固定化载体，如传统的无机载体材料二氧化硅、活性炭、玻璃珠等，再如有机高分子载体大孔型聚N-氨乙基丙烯酰胺-聚乙烯等。通过与该类型载体结合，本发明获得了高活力的固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶，该二酶以血红素和氧气为底物，在氧化型辅酶II辅助下高转化率(大于80％)生产胆红素。

附图的简要说明：

图1A：重组的血红素加氧酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，图中右边条带M并配有数字(单位是“KD”)是蛋白分子量标准，左边主带是重组的血红素加氧酶(粗提蛋白)，具体参见实施例3；

图1B：重组的胆绿素还原酶(粗提蛋白)之聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果，图中右边条带M并配有数字(单位是“KD”)是蛋白分子量标准，左边主带是重组的胆绿素还原酶(粗提蛋白)，具体参见实施例4；

具体实施方式：

利用本领域已知的技术，先分别构建含有编码血红素加氧酶和胆绿素还原酶的基因的载体质粒，然后转入大肠杆菌后，无须诱导培养，将表达的血红素加氧酶和胆绿素还原酶提取并固定于适当的环氧型酶载体，从而获得高活力的固定化血红素加氧酶和高活力的固定化胆绿素还原酶。该固定化血红素加氧酶和固定化胆绿素还原酶双酶合力催化，以血红素和氧气为底物，在氧化型辅酶II辅助下生产胆红素。