[发明专利]单体衣康酸的一种制备方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物技术领域，提供了一种单体衣康酸的制备方法。

背景技术

衣康酸(Itaconic acid)又名亚甲基丁二酸、亚甲基琥珀酸或分解乌头酸，是一种不饱和的二元有机酸。常温下为白色晶体，无毒，在酸性、中性和弱碱性常温条件下其性质稳定，但在强碱性条件下，其3种异构体可以相互转化，易溶于水、乙醇、丙酮，微溶于氯仿、苯和乙醚，有特殊的气味，在真空下能升华。

衣康酸及其酯类是制造合成树脂、合成纤维、塑料、橡胶、离子交换树脂、表面活性剂和高分子螯合剂等的良好添加剂和单体原料。它作为交联剂和乳化剂，含量在1％～5％时，生产的苯乙烯-丁二烯共聚物是质轻、易塑、绝缘、防水、抗蚀性能均好的塑料和涂料。用玻璃纤维填充则是一种高强度玻璃钢，可用于制造车，船和飞机的外壳及各种容器。含衣康酸的丙烯酸乳胶可以作为非织造纤维的粘合剂。含衣康酸单体的聚氯乙烯显示对纸张，赛璐玢和聚对苯二酸乙二醇薄膜的粘着性增强。聚丙烯腈纤维中含少量的衣康酸，就能大大改善其染色性能，使着色加深。加入多价金属氧化物(如锌和镁的硅铝酸盐或氧化物)交联的衣康酸-丙烯酸制成的牙科粘合剂具有良好的抗压性能和粘结强度，并有很好的生理适应性。衣康酸聚合物有特殊光泽，透明，适合于制造人造宝石和特种透镜，以及防水性能良好的抗化学剂和涂料等。衣康酸和丙烯酸的聚合物是一种高分子螯合物，用于作为水处理中的除垢剂，对防止碱性钙，镁垢的形成特别有效。加到海水蒸发脱盐体系中，有效成分为0.5～10mg/kg时就能有效的抑制水垢在蒸发器表面形成与附着。由衣康酸与芳香二胺生产的吡咯烷酮衍生物是润滑油的增稠剂，与其他各种胺生成的吡咯烷酮衍生物可用于洗涤剂、医药、除草剂之中。随着科学技术的发展和各个行业之间的交叉渗透，衣康酸的应用领域将会越来越多。

衣康酸自然界存在较少，最早是由Baup等人于1836年在蒸馏分解柠檬酸时发现的。1929年，日本学者木下广野首次发现了可分泌衣康酸的微生物，并命名为衣康酸曲霉(Asp.Itaconicus)。Raistrick在研究霉菌代谢产物时，发现土曲霉(Asp.terreus)也能分泌衣康酸，由此揭开了微生物发酵法生产衣康酸的研究历史。

衣康酸的生产方法主要有发酵法和化学合成法两种。化学合成法以原料的来源可以分为农产品和石油化工产品两种方法，农产品原料主要有柠檬酸、异柠檬酸、乌头酸及其酸酐等，石油化工产品原料主要有丁二酸酐、丁二酸二甲酯或丁二酸酯等。发酵法是目前工业上生产衣康酸的主要方法，国内外大多数生产厂家都采用这种方法来生产衣康酸。衣康酸的工业生产菌种主要是衣康酸曲霉(Asp.Itaconicus)和土曲霉(Asp.terreus)。所用的原料主要有葡萄糖、蔗糖以及淀粉水解糖、糖蜜等。发酵工艺主要有表面发酵工艺、深层发酵工艺以及固定化细胞生产工艺等。衣康酸表面发酵工艺具有设备简单，投资少，上马快，操作技术简单，能耗低以及原料粗放等优点，不足之处是设备占地面积大，劳动强度高，增大产量有困难，目前此方法在衣康酸的生产中已经很少使用。深层发酵工艺是现行工业上最流行、最经济的衣康酸生产方法，整个工艺过程的连续性强，自动化程度高，产品成本低。近几年，固定化全细胞生产衣康酸的研究比较活跃，使用的载体多为聚丙烯酰胺凝胶，利用包埋法固定衣康酸生产菌的全细胞，目前存在的问题是固定化细胞制备技术不过关，产率太低以及生产速度慢等，还有待于进一步的研究开发。因此，发酵技术仍然是衣康酸生产的研究点。

采用发酵法生产单体衣康酸，菌种保存过程中由于经过多次传代，衣康酸的产量都有不同程度降低，同时许多学者试图通过提高衣康酸的产酸率来降低衣康酸生产成本，例如采用固定化技术，但由于衣康酸的发酵与供氧关系甚密，采用固定化技术后，无论是发酵产酸，还是转化率均难以与以游离细胞的方式进行的工业化生产水平相比。

发明内容

本发明的目的是要寻找一种诱变方法使菌株具有较高产量，同时，采用新的生化反应器代替机械搅拌罐，以提高衣康酸产酸率。

本发明的整体技术构思是：以土曲霉为出发菌株，微波诱变获得高产衣康酸菌株，采用气升式发酵罐发酵，分离纯化单体衣康酸，其特征在于具体包括以下步骤：

1)微波诱变

土曲霉ZS01出发菌株，斜面活化，将孢子用0.85％无菌氯化钠洗下，倒入装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，35℃，摇床振荡活化1h，制备单孢子悬液。微波照射15s，将处理过的孢子悬液进行梯度稀释，涂布于平板。挑平板上透明圈大的单圈落，35℃，上摇瓶发酵72h，获得衣康酸高产菌株，产酸91.3g/L；

2)种子培养