[发明专利]一种鉴定大豆疫霉β-微管蛋白基因核苷酸点突变及其对苯酰菌胺抗药性的方法

说明书

技术领域

本发明涉及大豆疫霉β-微管蛋白基因的克隆及其在杀菌剂苯酰菌胺抗性监测中的应用，具体公开一种快速鉴定大豆疫霉β-微管蛋白基因核苷酸点突变及其对苯酰菌胺抗药性的分子检测方法及专用引物。属于分子生物学技术领域。

背景技术

大豆疫病是由大豆疫霉(Phytophthora sojae Kaufmann&Gerdemann)引起的一种具有危险性、毁灭性的卵菌病害。其在大豆各生育期均可发病，其中感病品种一般减产25％～50％，高感品种可达90％以上，甚至绝收；并且籽粒蛋白含量明显下降，使用价值受到影响。该病害自1948年在美国印第安纳州东北部首次被发现后，迅速扩展到巴西、阿根廷等20多个国家。在我国则主要发生在黑龙江、安徽、福建等省，为重要的外检和内检病害。

大豆疫霉为同宗配合的卵菌，自然条件下即可发生有性生殖，加速了基因的重组与交换，使得田间大豆疫霉菌株的遗传多样性越来越丰富；而且大豆疫霉生理小种毒性变异明显，新小种层出不穷，许多大豆抗性基因已被新的小种所克服，抗病资源失去效用。而化学防治的快速有效，使之成为该病害防治中较为重要的措施。但目前国内外专门用于卵菌病害防治的杀菌剂种类较少，其中最具有代表性的是以甲霜灵为代表的苯酰胺类杀菌剂，是第一代专门用于防治卵菌病害的一大类重要的内吸性杀菌剂。然而，由于该类杀菌剂的作用位点较为单一，而且大面积广泛使用，致使病原菌对该类药剂的抗药性接踵而至，并且发展迅速，目前病原菌对甲霜灵的抗性问题已尤为严重。而苯酰菌胺(zoxamide)则是在此背景下应运而生的一种对卵菌具有特效的苯甲酰胺类杀菌剂，是目前市场上唯一一种作用于微管蛋白的杀卵剂。该类杀菌剂在2001年开始商品化，并已在欧美地区广泛使用，在我国也已正处于登记推广当中。

尽管苯酰菌胺主要用来防治卵菌病害，它对Botrytis cinerea、Venturia inaequalis、Monilinia fructicola、Mycosphaerella fijiensis和Cercospora beticola等病原真菌也具有一定的活性。已有研究表明苯酰菌胺与苯并咪唑类杀菌剂具有类似的作用机制，均作用于靶标菌的β-微管蛋白。以多菌灵为代表的苯并咪唑类杀菌剂在田间使用后，抗药性问题很快产生并日益严重，FRAC(Fungicide Resistance Action Committee)将其列为高等抗性风险的杀菌剂。已有报道表明，苯并咪唑类杀菌剂的抗性主要是由于病原菌β-微管蛋白第198位和200位氨基酸发生了位点突变所造成，并且已建立了相应的田间快速检测方法，包括等位基因特异性PCR(Allele-specific polymerase chain reaction，AS-PCR)等。目前，大豆疫霉对苯酰菌胺的抗药性分子机制还未明确，而明确其具体的抗性基因，建立抗性分子检测方法，可以对抗性菌株进行早期检测，了解其抗性发展的动态，制定合理的病害管理方案，以延缓抗药性的产生。

传统生物学方法和分子生物学方法是植物病原菌抗药性检测或监测中常见的两种方法。传统生物学方法即是指测定药剂对病原菌的EC₅₀以区分敏感和抗性菌株，需要多个药剂处理，多次重复，检测周期长、工作量大、消耗的人力资源和材料较多；而且这种方法检测灵敏度低，要求抗药性菌株的突变频率在1％以上。而分子生物学方法，从提DNA到特异性PCR或酶切分析，检测所需时间短、检测的灵敏度高，检测频率在10^-5～10^-4，更适用于检测低频率的抗药性基因，因此也被作为田间抗药性早期诊断的理想方法。

发明内容

本发明旨在提供一种检测或辅助检测大豆疫霉中β-微管蛋白基因是否存在突变位点的方法及其专用引物对。

本发明所提供的检测或辅助检测大豆疫霉中β-微管蛋白基因是否存在突变位点的方法，包括如下步骤：

以待测大豆疫霉的基因组DNA为模板，用SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示引物对进行PCR扩增，若PCR扩增产物为288bp的片段，则所述待测大豆疫霉中β-微管蛋白基因存在或候选存在突变位点；

所述突变位点是指大豆疫霉中β-微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第716位核苷酸为C。

所述大豆疫霉中β-微管蛋白基因的基因组序列自5’末端起第716位核苷酸也就是SEQ ID NO：3中自5’末端起第716位核苷酸。

上述过程中，所述PCR扩增中，退火温度为67℃。