[发明专利]一种原位测定木质纤维生物质酶可及性的方法

权利要求书

1.一种原位测定木质纤维生物质的纤维素酶可及性的方法，其特征在于：包含以下步骤：

（1）向木质纤维生物质样品中加入初始探针浓度为E_t的纤维小体荧光蛋白探针溶液，标记样品的总的酶结合位点；

（2）用荧光显微镜原位观测和计数木质纤维生物样品上荧光标记的总的酶结合位点的分布及数量，用荧光光度计测定标记溶液的上清液中游离纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fa，与初始探针浓度E_t相比较，采用差量法计算得样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度E_a，并计算单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_ua；

（3）用洗脱液脱附样品上吸附的纤维小体荧光蛋白探针，释放总的酶结合位点；

（4）将步骤（3）处理获得的样品用木质素吸附蛋白封闭后，用初始浓度为E_t的纤维小体荧光蛋白探针溶液标记样品中的纤维素酶结合位点，再按照步骤（2）的操作过程，得到样品的纤维素酶结合位点的分布及数量，游离的纤维小体荧光蛋白探针浓度E_fd，样品表面吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度E_d，以及单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_ud；

（5）比较步骤（4）和（2）的结果，以二者的结果之差得到不可降解的酶结合位点的数量及单位面积吸附的纤维小体荧光蛋白探针量E_n，结合上述的酶结合位点及可降解的酶结合位点的分布、数量及吸附的纤维小体荧光蛋白探针浓度，评价木质纤维生物质的纤维素酶可及性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中的总的酶结合位点包括非纤维素酶结合位点和纤维素酶结合位点。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的纤维小体荧光蛋白探针是一种采用荧光蛋白标记的纤维小体片段，其蛋白序列包括两部分：一端是来自于微生物纤维小体的纤维素结合模块蛋白CBM，另一端是荧光蛋白FP，其中CBM可与木质纤维生物质的酶结合位点结合，但不产生荧光信号；与CBM相连的荧光蛋白能够产生荧光信号，而不与位点结合，

其中荧光蛋白选自绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白或蓝绿色荧光蛋白。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中标记是在含有2.0~8.0μM纤维小体荧光蛋白探针/L缓冲液体系中进行，缓冲液体系的pH值为5.0~7.0，体积为200μL~1mL，缓冲液的浓度为50~200mM，标记温度为15~60℃，避光标记0.5~2h；其中所述的缓冲液为磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液中的一种或一种以上。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（2）荧光显微镜原位观测是指测 定同一视野范围不同焦面的酶结合位点分布及数量的总和，荧光显微镜的参数包括：激发波长400~650nm，最大发射波长420~700nm；放大倍数为100~1000倍及焦面深度0~100μm；

其中，激发波长及最大发射波长的具体数值依据用于荧光标记的纤维小体荧光蛋白探针类型确定；优选地，GFP的激发波长：480~490nm，最大发射波长：505~515nm；

RFP的激发波长：553~558nm，最大发射波长：570~585nm；

YFP的激发波长：508~525nm，最大发射波长：524~538nm；

BFP的激发波长：400~420nm，最大发射波长：450~465nm；

CFP的激发波长：455~465，最大发射波长：478~488nm。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的步骤（3）的洗脱液是指浓度为0.5~5.0%的十二烷基硫酸钠的水溶液；

或所述的步骤（3）中脱附的温度为75~95℃，脱附时间为10~60min；用洗脱液脱附后的木质纤维生物质样品，需依次用75%乙醇及蒸馏水各清洗3遍。