[发明专利]一种提高α-熊果苷产量的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚，通过野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243发酵催化固定化对苯二酚与双糖合成α-熊果苷的制备方法。 

背景技术

α－熊果苷具有显著抑制酪氨酸酶的活性，可以减少酪氨酸酶在皮肤中的沉积，对皮肤有漂白、防色变和祛斑的功效。在比较α-熊果苷与其同分异构体β-熊果苷的美白效果时，Kazuhisa Sugimotod等通过人体黑素瘤细胞的实验，发现α-熊果苷的美白效果是β-熊果苷的10倍以上。目前，α－熊果苷是国际公认的并正在极力推广的高效、安全的美白剂，是美白、祛斑、防晒化妆品理想的添加成份。 

作为α－熊果苷合成反应物的对苯二酚具有杀菌作用，它可以通过降低细胞内巯基水平及升高活性氧水平改变细胞内氧化还原状态而引起细胞凋亡。当α-熊果苷合成反应体系中对苯二酚浓度超过一定量时,会对菌体产生抑制作用，导致菌体催化能力下降，不利于α－熊果苷的生产。因此，研究一种既可以提高反应体系对苯二酚浓度又可以降低其毒害作用的方法，成为大规模低成本生产α－熊果苷的必然选择。 

固定化(immobilized)技术是用化学或物理手段将物体定位于限定空间区域的一门新兴技术，在化工、发酵、能源、医药等行业应用广泛。大孔吸附树脂是一类具有大孔结构的高分子吸附树脂，有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物，具有物理化学稳定性高、比表面积大、吸附容量大、选择性好、吸附速度快、解吸条件温和、再生处理方便、使用周期长、宜于构成闭路循环、节省费用等诸多优点，已在环保、食品、医药等领域得到了广泛的应用。 

目前，由于利用化学合成方法很难合成α－熊果苷，所以关于α－熊果苷的制备方法主要通过生物转化法来实现。如今关于α－熊果苷生产的报道主要有日本Kohtaro Kirimura，国内张鹏、李群良、姜岷、庞宗文及杜刚等。但这些方法均存在以下一些问题： 

一、催化剂（菌体或酶）对对苯二酚的耐受度不高，导致α－熊果苷的产量也不高； 

二、α-熊果苷转化率不高，导致原材料利用率不高； 

三、产物α－熊果苷后续分离纯化工艺复杂、设备投资及操作费用均较大； 

四、生产过程有含对苯二酚废水产生，污染环境。 

为了克服这些问题，固定化对苯二酚是最好的解决办法。通过把对苯二酚固定在大孔吸附树脂上，使得发酵液溶液中的对苯二酚浓度基本为零，菌体的生长代谢将不受任何影响，可以更好地催化合成α－熊果苷；此外，把对苯二酚固定在大孔吸附树脂上，可以大大提高催化剂对对苯二酚的耐受度，提高单位体积发酵液中对苯二酚的浓度，从而大大提高α－熊果苷的产量；再者，待反应结束后，产物和未反应的对苯二酚依然固定在树脂上，产物后续处理只需用简单过滤即可把产物和发酵液进行有效分离，大大简化了后续产物分离纯化工艺及设备投资，并减少了发酵液中含对苯二酚废水排放，对环境的污染基本没有。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用固定化对苯二酚提高菌体对对苯二酚耐受度，提高单位体积发酵液中对苯二酚的浓度，进而提高α－熊果苷的产量。其中固定化对苯二酚即采用大孔吸附树脂吸附法对对苯二酚进行固定化，并用此固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌CGMCC NO.1243催化合成α－熊果苷的反应物，在最佳反应条件下催化合成α－熊果苷。该方法具有提高菌体对对苯二酚的耐受度，简化产物后续分离纯化工艺，减少含酚废水排放等优点，大大降低了α－熊果苷生产成本低，为大规模低成本生产α－熊果苷奠定了基础。 

本发明的整体技术构思是： 

利用大孔吸附树脂固定化对苯二酚作为野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243催化合成α-熊果苷的反应物，该方法由下列工艺步骤组成： 

（1）固定化对苯二酚的制备； 

（2）野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris）CGMCC NO.1243的发酵，其中包括种子培养和发酵罐培养； 

（3）加入固定化对苯二酚和双糖进行合成反应； 

（4）α-熊果苷的分离纯化。 

本发明的具体工艺步骤及工艺条件是： 

步骤（1）中固定化对苯二酚的制备：