[发明专利]茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进

说明书

技术领域

本发明涉及氨基残余物的定量检测，尤其适应新固相多肽合成中，经茚三酮试剂处置，测得吸光值，制得标准曲线，用于判定未知树脂肽中的残余氨基含量的方法。

背景技术

在固相法合成多肽的过程中，游离的氨基数量是合成完成度的一种直接体现，但是现在没有一个准确的方法可以得到残余氨基的具体数量，以验证其结果的可信度与准确性；因此制作标准样品与标准曲线用于对未知树脂肽中游离的氨基进行定量分析，有着重要的实践价值。

常规茚三酮检测法用于固相多肽合成中的-NH2残基定量的检测，一般均采用将反应后树脂的吸光值代入公式，通过计算来确定合成率，此结果易受反应时间、加热温度、加热时间等因素影响，而且由于存在试剂配制的批次差异，从而使结果会有较大的浮动，而且由于合成的不断进行，氨基酸的增加，也会使得树脂肽重量发生变化，使得结果判定上的准确度大打折扣，为了避免上述情况的出现，该项目对茚三酮反应试剂进行了改进，可以在短时间内得出一个稳定的结果，并使用脱去保护基后的合成用树脂作为标准品，建立一条标准曲线，使所有的反应均在同一条件下进行，从而保证了结果的可信度，可以更可靠的对游离氨基进行定量。

文献检索披露：常规茚三酮检测法多是通过颜色的变化来对缩合完成度进行判定；该方法使用2种试剂，试剂A：取0.66mg/ml氰化钾水溶液2ml加入到98ml吡啶溶液中，再加入4g/ml苯酚乙醇溶液10ml，混匀；试剂B：称取500mg茚三酮溶于10ml无水乙醇中；进行合成完成度检测时，取缩合反应完成后的树脂肽3mg，使用无水乙醇清洗3次，真空干燥后，加入试剂A 0.15ml，试剂B 0.05ml，100℃加热10分钟，看颜色变化来判定缩合完成度，颜色如果为蓝色或绿色就判定为缩合不完全，显黄色判定为缩合完全。

本发明构思是改进的固相多肽合成中的残余氨基定量分析方法，用合成的树脂作为标准品，制作标准曲线，对合成率进行一个判断，其解决的主要问题，一是合成树脂标准的建立；二是对游离氨基定量检测范围的确定；三是吸光值的稳定性的确定；四是反应液改进后不加氰化钾，减少反应液配制的危险性，该定量方法有重要的应用推广价值。

发明内容

本发明的目的在于：改进的固相多肽合成中的残余氨基定量分析方法，依据标准品树脂的吸光值制作标准曲线，可以得到未知树脂肽样品中的残余氨基含量，实现了准确定量。

本发明的目的是这样实现的：茚三酮检测法对固相多肽合成中的游离氨基定量方法改进，用与合成反应相同的Rink_Amide_MBHA树脂作为标准样品，制作标准曲线，对未知的样品进行残余氨基定量检测，其步骤如下：

其1样品处理：

称取Rink_Amide_MBHA树脂2g,计算树脂摩尔数A；用带Fmoc保护基的氨基酸，每种氨基酸取2A摩尔；将1A摩尔的Rink_Amide_MBHA树脂与2A摩尔的带Fmoc保护基的氨基酸，依次置于含8%碳化二亚胺的氮甲基吡咯烷酮溶液的容器中，反应2小时，得到树脂肽；再经25%哌啶溶液26ml，处理30分钟，得到去除保护基后的树脂肽，备用；

其中25%哌啶溶液的配制：25ml哌啶+75ml氮甲基吡咯烷酮混匀得；

其中树脂摩尔数的计算公式：

A-mSD]]>

式中：A为Rink_Amide_MBHA树脂的摩尔数；

m为Rink_Amide_MBHA树脂的克数；

SD为Rink_Amide_MBHA树脂取代量值；

其2检测步骤：

1）将取去除保护基后的树脂肽15mg，使用无水甲醇溶液20ml对其清洗3次，经真空干燥机处置，其温度45℃，真空度93.3～98.6KPa；干燥结束，称取1.0mg，1.5mg，2.0mg，2.5mg，3.0mg；分别加入300ul Buffer A：和75ul Buffer B，混和均匀，用100℃水浴加热15min，并置于15-20℃水中冷却至室温；取25ul的反应后的混合液加入到1.0ml的60%乙醇溶液中，混和均匀后，在OD570下进行吸光值读取，并制作标准曲线；