[发明专利]一种“转录激活子样效应因子-功能基团-雌激素受体”功能蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种“转录激活子样效应因子(Transcription Activator Like Effectors，TALE)-功能基团-雌激素受体(Estrogen Receptor，ER)”功能蛋白以及上述功能蛋白的应用，特别涉及上述功能蛋白可控地进入细胞核中对特定基因进行操控的应用。 

背景技术

在后基因组时代，我们迫切需要高效的基因操纵、合成等新型的生物工程技术。比如，我们常常需要抑制或沉默一个基因的表达。传统的基因敲除(Gene Knockout)技术依赖于细胞内自然发生的同源重组，其效率非常低，通常为10^-6级；RNAi技术虽然简单易行，但是又很难获得百分之百的抑制效果。除了抑制或沉默特定的基因，我们常常还需要针对特定基因，进行某几个碱基，甚至某一段序列的修改。同样只依赖于同源重组技术，很难获得理想的效果。 

TALE(Transcription Activator Like Effectors)首先是植物病原菌黄单胞菌(Xanthomonas)上发现的，特异性地结合到DNA，在该病原菌感染过程中对植物基因进行调控。TALE蛋白可以穿过核膜进入细胞核内与特定的DNA结合域结合，调控植物基因组中与疾病和抵抗力相关基因的表达。简单讲，TALE是由4个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”和两侧的N-末端及C-末端序列组成，而每个“蛋白模块”包含34个氨基酸，其中第12和13位氨基酸是靶向识别的关键位点，被称作重复可变的双氨基酸残基(repeat variable diresidue，或者RVDs)。TALE识别DNA的机制在于DNA靶点上的一个核苷酸被一个重复序列上的RVD识别。 

理论上，针对A、T、G、C任何一个碱基，都能找到与之特定结合的RVDs。因此，对任何一段DNA序列，我们可以方便的设计、合成出对应蛋白模块组成的TALE。需要指出的问题是，1)虽然针对A、T、G、C都可以设计出对应的RVD，但是，它们之间的对应关系还有待于进一步优化；2)设计合成的TALE能否高效地靶向结合基因组上的预期位置，还决定于很多其它因素；3)蛋白模块的组成也有进一步优化的空间。 

虽然TALE还有很多问题有待于深入研究加以解决，但是这并不妨碍它的应用。一个最大的应用前景是TALEN。TALEN是一个融合蛋白，由与某段DNA序列特异性识别TALE与能在DNA序列上产生双链断裂(double strand break，DSB)的内切核酸酶(Nuclease)融合而成。TALEN是异源二聚体分子(即两单位的TALE-Nuclease共同作用)，能够在两个相隔较近的特异识别 序列间切割DNA。 

TALEN产生的DSB能够通过以下两种途径进行修复：1)非同源末端连接(Non Homologous End Joining，NHEJ)：NHEJ是以自然修复机制，能被用来引入核苷酸缺失以便失活或敲除一个特异性的靶基因；2)同源重组(Homologous Recombination，HR)：DSB促进同源重组，在一个DNA模版存在下，能够产生特异性DNA序列改变，也能够将转基因整合到DNA序列上。NHEJ途径可以用于基因沉默，而HR可用于修改基因(Gene Editing)，或者基因敲入(Gene Knock-in)。无论是哪种途径，TALEN产生的修复与单纯依赖于同源重组相比，基因发生重组的效率大大提高，这为我们从事基因组订制化(genome customization)提供方便的技术手段，为开发出更简易的新型基因组靶向修饰技术带来了新希望。 

TALE另外一个大的应用前景是TALEA(transcription activator-like(TAL)effector activator)。TALEA是一个融合蛋白，将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64 Activation Domain)融合，可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA。该融合蛋白将结合基因启动子附近的特异DNA序列，并通过VP64激活区域与Polymerase II结合，从而激活基因的转录，提高了内源目标基因的表达。在实际操作中，需在目标基因的启动子上游选取靶序列(一般12-18个碱基)，构建TALE识别模块。 

TALE技术已经开始在生命科学领域崭露头角。2011年，法国和美国两个小组合作，利用TALEN技术，在大鼠中敲除失活IgM功能，效率高达60％。2011年，包括中国在内的几个小组，利用TALEN技术，在斑马鱼中，敲除失活hey2等基因，效率也达到了30％以上。