[发明专利]人源血液或间充质干细胞分泌exosome的制备与应用

说明书

 

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及从健康人体的血液或者干细胞培养上清液中提取间充质干细胞，经过体外分离，从血清或培养液上清中提取获得具有生物活性的exosome并应用。

背景技术

Exosome是一种由细胞分泌的纳米量级的膜性小囊泡，50年前首次发现由绵羊的网状细胞（reticulocytes）分泌，现已证实可以由多种细胞分泌，如：B细胞、树突细胞、肥大细胞、T细胞、血小板细胞、施旺氏细胞、肿瘤细胞、精细胞等。尿液和血浆等多种体液中也发现exosome的存在。

Exosome具有特定的生物物理和生物化学特性。其直径为40-100纳米，蔗糖密度为1.13-1.19克/毫升，可以在100,000g的离心力下沉淀。不同细胞来源的Exosome所含有具体成分不同，一般而言，它含有以下几种物质：MHC I类和（或）II类分子、热休克蛋白、四跨膜蛋白、整合素、细胞骨架蛋白及生物酶类。

Exosome内各成分的特性决定了exosome可以执行不同的生理功能。Exosome富含胆固醇、鞘磷脂、神经酰胺、蛋白质、RNA等生物活性因子，这些生物活性因子可以有效调控机体细胞信号转导，进而生理性修复或者清除机体损伤，病变和衰老的细胞。Exosome的生理功能最初由Raposo G于1996年研究调节免疫通信时发现，由抗原呈递细胞（APC）分泌，具有转运MHC抗原呈递复合物的作用。这项发现也提供了exosome可用于疾病治疗的理论依据。随后的研究发现了exosome更多的治疗潜力。例如，exosome可以抑制肿瘤的生长；exosome可防止急性心肌梗塞和急性肾小管损伤等。近年来研究发现exosome与神经元的通信或发病机制有关。由神经元、星形胶质细胞和神经胶质细胞释放的exosome可清除不需要的应激蛋白和阻止淀粉样蛋白原纤维的形成，从而减轻阿尔茨海默氏综合Exosome的旁分泌作用，使其作为替代传统的间充质干细胞(MSC)成为再生医学治疗中应用的新技术成为可能。近年来，由各种干细胞所分泌的exosome在修复各种组织损伤方面的应用得到了广泛的研究。Exosome中含有大量的生长因子，如血管内皮细胞生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、血小板增殖因子（PDFG）、酸性成纤维细胞生长因子（aFGF）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和肿瘤生长因子（TGF-β）等，具有抑制细胞凋亡和纤维化，促进血管发生和有丝分裂，介导免疫反应的作用。实验证明，在使用间充质干细胞所分泌的exosome治疗急性肾损伤时，exosome所含有的胰岛素样生长因子（IGF-1）和血管内皮细胞生长因子（VEGF）扮演了关键性的角色。在免疫学方面，间充质干细胞分泌的exosome脂膜表面表达有多种膜蛋白，包括凝血因子（TF），肿瘤坏死因子（TNF），MHC I类和II类分子以及CCR5趋化因子受体等，^， 。通过这些表面分子，间充质干细胞可以调控T淋巴细胞，树突细胞，天然杀伤细胞等免疫细胞的活性，从而起到抵抗炎症的作用。

    除了可以减轻细胞移植的风险，exosome作为一种双脂质膜囊泡，还有能力将小的可溶性生物因子如生长因子，趋化因子，细胞因子，转录因子，基因和RNA等转运到正确的靶细胞，同时保持这些因子的稳定性、完整性和生物效价，防止被酶或化学品所分解。实验表明，由MSC分泌的exosome，脂膜结构完整时可以保护所包裹的蛋白质和RNA不被胰蛋白酶和RNA酶降解；由MSC分泌的exosome可以在-20℃条件下存储6个月而不会降低其心脏保护作用^, 。最近有科学家利用这一特性发明了用exosome作为载体向脑部运送siRNA的治疗方法。

    此外，由于exosome与一些疾病的病理生理密切相关，因此可作为检测一些疾病的方法。研究报道，血液中exosome的miRNA的可以用来指示和诊断卵巢癌；尿液中exosome的蛋白质可以作为反映急性肾损伤的诊断标志物。

    因此，利用exosome调控机体细胞通信，进而激活自身细胞生理性修复或清除机体损伤，病变及衰老的细胞， 在疾病防止与美容保健领域具有广阔的应用前景。但exosome的体积小，密度低，提取过程繁杂、产量也低，从而制约了对exosome的进一步研究和应用。

鉴于上，我们研究开发从健康人体液或干细胞培养液上清中提取exosome，并在储存中保持其生理活性的方法，利用这种生物活性物质激活人体自身细胞来生理性修复或替代集体损伤，病变和衰老的组织细胞。

发明内容