[发明专利]似活的非可培养状态的可培养细菌及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌及其制备方法。

背景技术

细菌VBNC状态是指细菌在不良环境中，细胞缩成球形，用常规方法（平板法、最大可能近似值法）培养时，不能生长繁殖，但仍然是活的一种特殊存在形式。

细菌活的非可培养状态(Viable but Non-culturable, VBNC)的复苏是指将不能培养的细菌恢复为可培养状态的过程，目前，国内外用于VBNC沙门氏菌复苏的方法主要源自于Reissbrodt等人在2002年发表在Applied and Environmental Microbiology 刊物上的一篇题为《Resuscitation of Salmonella enterica Serovar Typhimurium and Enterohemorrhagic Escherichia coli from the Viable but Nonculturable State by Heat-Stable Enterobacterial Autoinducer》的文章。文中提及的VBNC沙门氏菌复苏所需主要材料为含有30％牛血清和50μmol/L去甲肾上腺素的SAPI培养基，基中SAPI培养基成份较为复杂，由6.25mmol/L NH₄NO₃，1.84mmol/L KH₂PO₄，3.35mmol/L KCl，1.01mmol/L MgSO₄，2.77mmol/L(pH=7.5)葡萄糖等组成。主要复苏步骤如下：首先将SAPI培养基6000 r/min，离心15min，上清液过滤除菌。然后将滤后的上清液涂于羊血琼脂平板上，37℃厌氧培养48h，以检测培养基中是否有杂菌污染。最后将可能含有10²～10³ 个CFU/mL浓度的VBNC沙门氏菌无菌接种于SAPI中，37℃厌氧培养至OD₆₂₀＝0.4时，细菌数量增多，浓度可接近10⁸个CFU/mL。通过此法可以使维持VBNC长达1年的细菌恢复为可培养状态。

细菌VBNC状态自20世纪80年代发现至今，一直是预防医学、流行病学、微生物生态学以及公共卫生检验检疫方面研究的热点问题之一。现阶段，人们已在VBNC细菌诱导、检测、致病性等方面取得重要成果，并且在分子水平上也对该状态有了进一步地了解和认识。但是摆在现阶段的一个瓶颈问题，即VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，这使得研究者无法做更为深入地研究。也就是说，只有准确捕获VBNC状态，才能对该状态细菌进行系统研究。然而遗憾的是，在VBNC领域中至今尚未获得具有稳定遗传性状的研究模型。也正因如此，有关VBNC状态发生机制的研究也只停留在某一（些）已知基因（如大肠杆菌、霍乱弧菌的毒力基因）在正常与VBNC状态下表达情况的比较，尚未能对VBNC发生机制做客观评述。因而，凭借VBNC特异性基因建立针对VBNC细菌检测方法的研究也只能停滞不前。尽管应用高通量的基因芯片技术能合理躲避瓶颈问题，可对VBNC发生机制进行深入研究，但是繁杂的工作以及大量的资金投入亦会使更多的研究者却步。

发明内容：

本发明目的是解决VBNC维持期内的细菌，其生物学性质难以稳定存在，而且极易在研究过程中突然消失，使细菌转入真正死亡期，使得研究者无法做更为深入地研究的问题，而提供一种VBNC细菌的研究模型，似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌及其鉴定方法。

似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌的鉴定方法，它包括：用常规的进入VBNC状态诱导方法诱导，可培养的既为似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌; 

同时设立对照组，所述的对照组为和待检细菌相同种类的标准细菌；对照组用常规方法培养不可培养；

所述的不可培养，连续常规培养3次，每次平板菌落数均为0。

所述的常规的进入VBNC状态诱导方法为在适合该种细菌的液体培养基中，4℃培养。

似活的非可培养状态（VBNC）的可培养细菌，它是通过上述方法中的任意一种方法鉴定的可培养细菌。

似活的非可培养状态（VBNC）的可培养鼠伤寒沙门氏菌，保藏号为CGMCC  No.  6578  。