[发明专利]一种反硝化菌的保藏方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种菌体保藏方法，具体涉及一种简单有效的低温冷冻保藏反硝化菌的方法。

背景技术

氨氮是国家实现水污染控制总量控制的污染物，水体中氨氮含量过高会引起水质富营养化，导致水体中某些藻类过度繁殖，其它生物生长受到影响，从而破坏了水生生态系统，导致水质恶化并影响到其使用功能。生物脱氮技术以其环保高效无二次污染等优点是目前国内外脱氮技术研究应用的热点。生物脱氮是在好氧条件下通过硝化反应先将氨氮氧化为硝氮或亚硝氮，再通过缺氧条件下的反硝化反应将硝氮或亚硝氮还原成气态氮从水中除去。由此可见，反硝化过程才是真正脱氮的步骤，而完成反硝化的高性能反硝化菌被选育出来后，如何能够长期有效的保藏至关重要。

微生物菌种是重要的生物资源之一，一个优良的菌种被选育出来以后，必须保持其优良性状不变或尽可能地少变慢变，才不至于降低菌体性能，能长期应用于生产中。菌种保藏的基本原理主要是根据其生理生化特征，人工创造条件，使微生物代谢处于不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态，即采取低温、干燥、缺氧等条件，使菌种暂时处于休眠状态。一种好的保藏方法首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便在生产上能推广使用。为了有效地保藏微生物菌种，就需要针对菌种的特性研究选用适宜的保藏方法。菌种保藏方法很多，目前国内外常用的有定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、超低温冰箱冷冻法、超低温液氮冷冻法等。其中定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法不适合大量菌种的保藏；超低温液氮冷冻法和超低温冰箱冷冻法等均需使用保护剂来制备细胞悬液，保护剂有牛乳、血清、糖类、甘油、二甲亚砜等，目的是防止因冷冻或水分不断升华对细胞的损害。冷冻保存是解决种质退化和防止自然积累性突变的一种有效途径，但传统的低温保存需要昂贵的程序降温仪器，步骤繁琐。完全玻璃化是低温保存的一种新方法，即在高浓度保护剂下，细胞连同保护剂于快速降温中都进入玻璃化状态，避免胞内冰晶形成，使器官和组织各部分都进入相同的状态，具有设备简单、程序简单和冻存效果好等优点。但是保护剂仅能保证菌体的存活率，对菌体活性是否有影响及影响的程度还不明确。

CN200810124325.5提供了一种菌种保藏方法，采用半固体、低温密封培养的方法：将菌种接种于无菌的半固体培养基中，倒入无菌液体石蜡后竖直存放入6～8℃的环境温度中保存。所述菌种为金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、黑曲霉或白色链珠菌。采用此方法可延长菌种的保存时间，同时菌种的浓度保持相对稳定，为生产、试验节约了大量的成本，减少了菌种使用后废弃物的处理和排放，减少了对环境的危害。但是工序复杂繁琐，不适合大量菌体的保藏。

CN201010299763.2提供了一种冷冻保存红细胞的方法，向红细胞中加入还原剂和甘油以及作为金属离子螯合剂的乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐；还原剂为抗坏血酸或抗坏血酸盐、半胱氨酸盐酸盐或N～乙酰半胱氨酸、硼氢化钠、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠或焦亚硫酸钠、还原型谷胱甘肽中的任意一种或者两种或两种以上的混合物，还原剂终浓度各为0.5～300mM；甘油的量以终体积比计为5%～10%；乙二胺四乙酸或乙二胺四乙酸盐的终浓度为0.1～10mM；充分混匀并调节酸度值至6.5～8.0，将容器封口，静置1小时后在-40℃以下冷冻保存。以该方法冷冻保存的红细胞，一年后解冻，红细胞破碎率大于95%，血红蛋白无变性，未被氧化为高铁血红蛋白。此种方法适合细胞保藏法，不适合菌种活性的保藏。

CN200810190852.6涉及一种菌种保藏方法，包括：(1)将需要保藏的菌种接种到灭过菌的麸皮培养基中；培养基配方为50～60%麸皮、35～45%粉碎后的谷壳、1～2%硝酸钠、1～2%尿素、1～2%米粉、0.2～1%生物素营养添加剂，加入上述混合物相同重量的去离子水，混合均匀即可；(2)当菌丝长到需要的菌龄时，不需分离出菌丝制成菌悬液，直接将冻干液立即加入安瓿管中与培养物混合均匀；冻干液配方为10～20克脱脂牛奶、0.2～0.5克琼脂粉、0.2～0.5克还原型谷胱甘肽、0.1～0.5克阿拉伯胶、0.5～1克叔丁醇，用去离子水定容到100毫升；(3)然后以2℃/分钟的降温速率降温，冷冻干燥；(4)冻干后对盛菌的安瓿管抽真空，然后封口；以及(5)将所得到的管置入低温下保藏。该法采用真空冷冻干燥法保藏菌体，需要采用缓慢的降温程序将菌体冻干进而低温保藏，步骤繁琐，能耗较高。