[发明专利]一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽及其应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫学与基因工程技术领域，具体涉及一种具有提高人NK及NKT细胞杀伤肿瘤细胞活性的多肽(简称HA-FC)及其在抗肿瘤中的应用。

背景技术

T淋巴细胞是免疫系统中主要的免疫细胞，在清除肿瘤细胞或病毒感染细胞中，Ｔ细胞的CTL发挥着重要的作用。但是CTL作用的前提是肿瘤或病毒抗原必须与自身细胞表面的MHC I类结合并递呈在细胞表面后才能被T细胞识别继而被T细胞清除，即所谓的MHC限制。然而，多数的肿瘤细胞以及部分病毒感染细胞为了逃逸机体的免疫监视，其细胞表面的MHC I类表达通常都明显下调甚至消失(称之为“缺失自我”)。此时，T细胞就无法发挥作用，机体对肿瘤细胞的免疫清除功能则主要由NK细胞来承担。与杀伤性T细胞不同，NK细胞的杀伤活性不需诱导即可直接杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞。因此，NK细胞在肿瘤的过继免疫治疗上，有着广泛的应用前景。

NK细胞杀伤肿瘤细胞作用与T细胞的CTL细胞毒作用不同，NK的细胞毒作用不需要肿瘤抗原与MHC结合，就能够立即杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞。它的活性依靠其细胞表面的受体与靶细胞表面的配体相互作用来实现，这种激活是非特性的激活。此外，NK细胞还是连接特异性免疫与非特异性免疫的桥梁。抗体介导的特异性杀伤作用在NK细胞的抗肿瘤与抗病毒中也具有重要的作用。NK细胞通过自身表面的CD16与特异性抗体的Fc段结合，发挥ADCC作用(“抗体依赖性的细胞介导的细胞毒作用”，antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)。在抗体介导的ADCC作用过程中，抗体能与靶细胞上的相应抗原表位特异性结合，而NK细胞可杀伤任何已与抗体结合的靶细胞，抗体与靶细胞上的抗原结合是特异性的，NK细胞等对靶细胞的杀伤作用是非特异性的。在抗肿瘤与抗病毒免疫中，通过ADCC的效应，能使NK的抗肿瘤、抗病毒活性发挥更高、更强的效能。

NK细胞与NKT细胞具有类似的抗肿瘤活性，但两种细胞来源不同：NKT来源于T淋巴细胞。NK细胞直接由淋巴系干细胞分化而来。表面标记上：NK细胞为CD56阳性、CD3阴性；NKT为CD56阳性、CD3阳性。

噬菌体随机肽库是一种有效寻找能与某一特定目标蛋白特异结合的蛋白并确定其氨基酸序列的技术方法。噬菌体随机肽库有商品化的产品，筛选的结果取决于包被在96孔板上的目标蛋白。商品化的噬菌体随机肽库是由上亿种氨基酸随机排列的短肽与噬菌体外壳蛋白在基因水平进行连接后，以融合蛋白的形式表达(呈现)在噬菌体表面的多肽。库中上亿种多肽分别呈现在上亿个噬菌体表面，众多重组型噬菌体便组成了噬菌体随机肽库。随机肽库所用的噬菌体为丝状噬菌体。噬菌体随机肽库含有的大量不同序列结构多肽可作为筛选与任何靶蛋白表位结合的模拟肽。利用噬菌体肽库技术已经确定了许多蛋白分子的相互作用位点。

发明内容

本发明依据NK细胞借助抗体发挥ADCC作用的理论，首先，通过噬菌体随机肽库技术，分别筛选到了一条能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”(肿瘤细胞高表达的一种抗原，广泛存在于各种恶性肿瘤细胞中)特异结合的多肽：Gln His Ile Arg Glu Leu Pro Tyr Thr Gly Gly Ser Ala Arg His Tyr Gly Ser Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr；以及一条能与CD16特异结合的多肽：Ile Asn Pro Ala Trp Phe Ala Tyr Gly Gly Ser Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro tyr Thr。在此基础上，通过人工肽合成的方式，将这两条肽的特点(氨基酸序列)合成在一条完整的肽链上，即本发明所指的多肽HA-FC。该多肽的氨基端具有模拟抗体的功能，能与肿瘤抗原“天冬酰胺羟化酶”特异结合；多肽的羧基端则模拟抗体的Fc段功能，能够与NK细胞上的CD16分子结合。通过HA-FC多肽的桥梁作用，NK细胞与肿瘤细胞更贴近、结合更加牢固，最终使NK细胞通过释放穿孔素与颗粒酶杀伤肿瘤细胞的效率更高。

本发明的关键技术是获得了(筛选到了)能与天冬酰胺羟化酶特异结合的肽序列和能与CD16结合的肽序列。申请者采用噬菌体随机肽库的方法，分别以天冬酰胺羟化酶以及CD16为目标蛋白，对噬菌体肽库中能与天冬酰胺羟化酶结合的克隆以及肽库中能与CD16结合的克隆分别进行了筛选。筛选所用的目标蛋白是采用人工合成的天冬酰胺羟化酶肽段以及人工合成的CD16肽段，以这两种合成的多肽分别包被96孔板进行筛选。