[发明专利]一种改进的植物花粉管转化方法

权利要求书

1.一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：将外源质粒DNA重悬于质粒DNA保护剂中，制成外源质粒DNA的混合液；浓度为0.8-1.2 μg/μL，然后利用植物花粉管通道法转化到植物中。

2.根据权利要求1所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：所述的外源质粒DNA保护剂，它是氢氧化铝溶胶保护剂、磷酸钙保护剂和Tween20保护剂中的一种。

3.根据权利要求1或2所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：所述的外源质粒DNA的浓度为1 μg/μL。

4.根据权利要求1所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的：

（1）在一支玻璃试管中加入2-4mL 1%氯化铝溶液，再加入0.05-2 mL 10%氨水，使其形成沉淀；

（2）弃上清，用蒸馏水清洗沉淀3-5次，采用倾析法除去水分，最后一次用过滤法使洗液与沉淀分离；

（3）将沉淀转入150 mL烧杯中，加入蒸馏水20-80 mL，搅拌并加热煮沸；

期间加入0.1-0.2 mL 0.1 mol/L HCl溶液，不断搅拌，即可获得氢氧化铝溶胶；

（4）氢氧化铝溶胶重悬外源质粒DNA。

5.根据权利要求1所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的：

（1）用灭菌蒸馏水5-15 μL重悬外源质粒DNA，使其浓度为1 μg/μL，再加入50-60 μL 2 mol/L CaCl2溶液混匀；

（2）离心，将上清液取出，加入到400-450 μL灭菌蒸馏水中；得外源质粒DNA-CaCl2溶液；

（3）取一个2 mL灭菌的离心管，向其中加入500 μL， pH6.95-7.05 ，2×HEPES缓冲液，向HEPES缓冲液中以吹气的方式逐滴滴入外源质粒DNA-CaCl2溶液；

（4）将试管放于37℃水浴中孵育3-5 min，可见乳白色混浊出现；

（5）10000 r/min离心3 min，弃上清；所得的混合物即为磷酸钙-外源质粒DNA。

6.根据权利要求1所述的一种改进的植物花粉管转化方法，其特征在于：所述的外源质粒DNA的混合液是由下述的方法制备的：

（1）采用灭菌蒸馏水与蔗糖，配成浓度为8%的蔗糖溶液，115℃灭菌15-20 min；

（2）取上述蔗糖溶液与Tween20混合，制成浓度为5%的Tween20保护剂；

（3）取5%的Tween20保护剂10-20 μL外源质粒DNA。