[发明专利]一株黄单胞菌突变体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属基因工程技术领域，涉及一株黄单胞菌突变体及其构建方法和应用。

技术背景

纤维素是地球上储量最丰富的可再生资源，通过化学或生物分解，可转化为许多高附加值的产品，如乙醇、生物燃料等。微生物通过产生与分泌一系列纤维素酶来分解纤维素，产生中间产物葡萄糖，之后再进一步转化为下游的其它化学物质。与化学转化法相比，微生物转化更为简单、低耗与环保。为了提高最终高附加值产品的产量，研究者致力于通过增加中间产物即可溶性糖的浓度来实现。常见的方法有：筛选新的纤维素酶高表达菌株；基因工程改造增强现有菌株的纤维素酶表达水平，降低终产物的抑制效应；增强菌株的纤维素酶向外分泌的效率等。

但是，由于葡萄糖是绝大多数微生物的优势碳源，在微生物生长过程中会被优先利用。这会导致即使纤维素向葡萄糖转化的效率被提升，但是绝大部分由纤维素分解产生的葡萄糖会被微生物优先利用，不仅使葡萄糖累积量降低，还会抑制微生物分解纤维素的效率。因此，如何降低生物转化过程中的中间产物被消耗的水平，提高发酵液中葡萄糖的累积浓度，对于纤维素原料的充分利用和生物转化产品产量的提高具有重大意义。

很多植物病原体微生物可以合成与分泌多种纤维素酶，达到侵染植物的目的。黄单胞菌(Xanthomonas)是一种可引起植物“黑腐病”的重要的植物病菌，它能够产生并分泌多种胞外酶，如纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶和胞外多糖。同时，它具备完整的葡萄糖利用与转运系统，可有效地利用葡萄糖、甘油、果糖等多种物质作为碳源生长。已有研究证实，因其具有多个纤维素酶的编码基因并高效分泌多种纤维素酶，黄单胞菌可利用纤维素作为单一碳源生长，实现纤维素的分解。因此，本发明中我们选择了黄单胞菌为目标菌株。

发明内容

本发明的目的，就是为了降低生物转化过程中的中间产物被消耗的水平，提高发酵液中葡萄糖的累积浓度，提供一株黄单胞菌突变体及其构建方法和应用。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

一株黄单胞菌突变体，命名为XC2460，其保藏编号为CGMCC No.6583。

上述黄单胞菌突变体的构建方法，包括以下步骤：

A、通过两步同源重组法敲除野生型黄单胞菌菌株Xcc 8004的XC_2460基因；

B、分别使用上游引物对XC_2460-U-F/XC_2460-U-R和下游引物对XC_2460-D-F/XC_2460-D-R PCR扩增XC_2460的上游500bp片段和下游500bp片段；

C、以上述两个扩增的片段为模板，利用引物对XC_2460-U-F/XC_2460-D-R通过重叠PCR方法，将这两个片段融合；

D、将两个融合片段与质粒pK18mobsacB进行EcoR I/HindIII双酶切，回收酶切片段后，用T4DNA连接酶进行连接，获得质粒pK18mobsacB-Xc2460；

E、最后，借助于辅助菌株E.coli S17-1(λpir)接合的方式将质粒pK18mobsacB-Xc2460转入野生型黄单胞菌菌株Xcc 8004中；首先将接合子在含10μg/ml卡那霉素和25μg/ml利福平的平板上进行一次筛选，所得阳性克隆再转入含25μg/ml利福平和5％蔗糖平板上进行二次筛选，得到成功敲除了XC_2460基因的黄单胞菌突变体菌株，命名为XC2460。

上述黄单胞菌突变体的构建方法，其中，

所述XC2460-U-F的序列为：GTAGGAATTCgtgggtttggcgacgttggat；

XC2460-U-R的序列为：Aacacgccgatcagggtcag

XC_2460-D-F 的序列为：GGACCAGACCCTGGCACTGACCCTGATCGGCGTGTTttaccctggatttctacgccaagttc；

XC2460-D-R的序列为：GTAGAAGCTTttaccagaacaccgcgtacag。

上述黄单胞菌突变体在纤维素生物转化中的应用。

上述黄单胞菌突变体在纤维素生物转化中的应用，是通过限制黄单胞菌的葡萄糖转运系统来提高其在纤维素生物转化过程中胞外葡萄糖的累积量，葡萄糖作为纤维素生物转化过程中的中间产物，其向胞内的转运量下降，实现了其在胞外的大量积累，提高了胞外的葡萄糖浓度，有利于后续的进一步转化。