[发明专利]同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种同时鉴别9种鸡呼吸道病病原体的GeXP快速检测试剂盒。

背景技术

H5、H7和H9亚型禽流感病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒、鸡毒支原体、滑液囊支原体和传染性鼻炎是严重危害鸡的9种主要呼吸道传染性疾病。主要临床表现为：啰音、咳嗽、气喘、伸颈、张口呼吸、甩头和呼吸困难等症状。这些传染病感染不同年龄鸡群，具有较高的发病率和死亡率，其临床症状却十分相似，无法鉴别。鉴别诊断这些呼吸道疾病的传统方法，主要包括病原分离鉴定和血清学试验等，但这些方法常受临床病料新鲜度、污染程度或病程的限制，操作也十分繁琐、费时，对多重混合感染的鉴别诊断就更为困难。近年来，随着分子生物学的发展，PCR技术已被广泛应用于这些呼吸道病的检测，并建立了多重PCR检测技术，同时检测几种病原，但需几对引物组合在一起同时竞争地扩增，引物之间会产生相互干扰，多增加一对引物，敏感性就越低。PCR产物需通过琼脂糖电泳才可观察结果，该电泳难以区分50bp-100bp以内的条带，一般只可做到2-4重PCR，难以达到高通量的检测。多重荧光PCR一般只检测到3重，由于探针要标记不同发光波长的荧光基团，如标记太多的荧光基团，相互会产生干扰，因此，也只能检测到2-4重。由于在多重PCR反应体系中同时存在几对引物，使得形成复杂引物二聚体的概率大大增加，同时检测的目的基因数量有限（多在2-4个基因），使得多重PCR还达不到高通量快速检测和分析的目的。

GeXP系统(Gene Expression Profiler Genetic Analysis System)是美国BeckmanCoulter公司研发的用于研究多基因表达定量分析的平台，由两部分组成：用于设计引物的GeXP eXpression Profiler软件和用于结果分析的GenomeLabTM GeXPGenetic Analysis System毛细管电泳仪，后者可清晰分离出相差7bp以上的相邻扩增片段。GeXP多重PCR扩增采用荧光标记通用引物和特异性嵌合引物（即基因特异性引物5’端连接通用引物序列）相结合引发多重体系扩增。PCR反应之初，先由反向特异性嵌合引物与原始模板结合进行逆转录反应，再由正向特异性嵌合引物合成cDNA的第二链，此后，由正、反向嵌合引物的特异性序列以cDNA为模板启动PCR反应，分别扩增出通用引物的互补序列；再由反应体系中占主导地位的荧光标记通用引物，与其互补序列结合，引发后续扩增,通用引物与反应体系中带有荧光标记的碱基序列互补，PCR产物经GeXP毛细管电泳分离，含有荧光标记的PCR产物经GeXP检测窗口检测，依据检测片段与标准分子片段（DNA Size Standard,DSS）迁移时间计算出扩增片段的长度，荧光信号强度代表该分离片段的扩增含量。GeXP系统可在同一个体系里对多达40个目的基因进行有效分析。

利用GeXP多重基因表达遗传分析系统，建立一种能同时鉴别多种病原体的检测方法和检测试剂盒，关键是设计特异性引物，将多重引物组合，利用通用引物，把多重引物的扩增转化为1对通用引物的扩增，从而达到高通量检测的目的。目前，还没有基于GeXP系统的同时可检测家禽多种呼吸道传染性疾病病原体的试剂或试剂盒。

发明内容

本发明的目的是提供一种鉴定或辅助鉴定家禽呼吸道病病原体的GeXP快速检测的试剂或试剂盒，含有如下十种PCR引物对的十种、任意九种、任意八种、任意七种、任意六种、任意五种、任意四种、任意三种、任意两种或任一种：鉴定或辅助鉴定禽流感病毒的PCR引物对A，鉴定或辅助鉴定H5亚型禽流感病毒的PCR引物对B，鉴定或辅助鉴定H7亚型禽流感病毒的PCR引物对C，鉴定或辅助鉴定H9亚型禽流感病毒的PCR引物对D，鉴定或辅助鉴定新城疫病毒的PCR引物对E，鉴定或辅助鉴定传染性支气管炎病毒的PCR引物对F、鉴定或辅助鉴定传染性喉气管炎病毒的PCR引物对G，鉴定或辅助鉴定鸡毒支原体的PCR引物对H，鉴定或辅助鉴定滑液囊支原体的PCR引物对I，鉴定或辅助鉴定副鸡嗜血杆菌的PCR引物对J；

所述PCR引物对A由序列表序列1所示的单链DNA和序列表序列2所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对B由序列表序列3所示的单链DNA和序列表序列4所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对C由序列表序列5所示的单链DNA和序列表序列6所示的单链DNA组成；

所述PCR引物对D由序列表序列7所示的单链DNA和序列表序列8所示的单链DNA组成；