[发明专利]疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因及其应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

（二）背景技术

普瑞巴林（Pregabalin，简称PGB），化学名为(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸（Ⅰ），是γ-氨基丁酸的3位异丁基取代物（Angew.Chem.Int.Ed.2008,47:3500-3504）。普瑞巴林属钙离子通道调节剂，通过调节钙通道减少钙离子进入神经末梢，减少谷氨酸和去甲肾上腺素等兴奋性神经递质的过度释放（Curr.Opin.Pharmacol.2006,6:108-113.），对癫痫、神经病理性疼痛有良好的疗效。与传统药物相比，普瑞巴林的剂量更低、服用次数少、副作用小、持续时间长、耐受性强。自上市以来，普瑞巴林全球销售额快速增长，成为全球畅销药市场的“重磅炸弹”，市场前景十分广阔。

(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸（Ⅱ）是制备普瑞巴林的关键手性中间体，经加热脱羧、碱性水解和加氢还原即可合成普瑞巴林（Ⅰ）。美国Pfizer公司利用Novozymes公司固定化脂肪酶选择性水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸盐，底物浓度可达3.0M，转化率42~48%（Org.Process Res.Dev.2008,12:392-398；US2005/0283023）。

（三）发明内容

本发明的目的在于提供热稳定且高活性的疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体、编码基因，及其在水解外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯制备普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种疏绵状嗜热丝孢菌脂肪酶突变体，由克隆自Thermomyces lanuginosus DSM10635基因编码的序列如下的肽段经点突变获得：

1    RPVRRAVPQD LLDQFELFSQ YSAAAYCAAN NHAPVGSDVT CSENVCPEVD AADATFLYSF61    EDSGLGDVTG LLALDNTNKL IVLSFRGSRS VENWIANLAADLTEISDICS GCEGHVGFVT121   SWRSVADTIR EQVQNAVNEH PDYRVVFTGH SLGGALATIA AAALRGNGYNIDVFSYGAPR181     VGNRAFAEFL TAQTGGTLYRITHTNDIVPR LPPRDWGYSH SSPEYWVTSG NDVPVTANDI241   TvvEGIDSTD GNNQGNIPDIPSHLWYFGPISECD（下划线部分为突变可能发生的位点）；所述的点突变为下列之一或其中两种以上：（1）第88位的S突变为T；（2）第99位的A突变为N；（3）第116位的V突变为D。

本申请发明人进行了大量深入的实验，通过对来源为疏绵状嗜热丝孢菌（Thermomyces lanuginosus）DSM10635脂肪酶基因（SEQ ID No.1）进行克隆表达，利用PCR技术以含有脂肪酶基因的表达载体为模板进行定点突变，扩增后转化宿主细胞，诱导表达后利用显色法进行筛选，从而获得了一系列耐热并具有高催化活性的脂肪酶突变体。这些突变体能以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物，在常温和较高的温度下能高效手性生物催化生产普瑞巴林关键手性中间体(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸。上述突变体以外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯为底物其具有的活性比亲本（SEQ ID No.2）高出至少8.6倍的催化活性，且选择性和热稳定性不变。