[发明专利]一种花生籽仁的石蜡切片方法

说明书

【技术领域】

本发明涉及石蜡切片技术领域，具体地说，是一种花生籽仁的石蜡切片方法。

【背景技术】

花生籽仁是花生收获的主要目标产物，决定着花生产量和品质的形成，但花生籽仁在生长过程中容易受到黄曲霉等病菌的侵染。研究表明，花生种皮的低渗透性、强韧性及耐破损等特征使花生对病害、虫害具被动抵制作用，因此花生种皮的完整性、强度对花生抗黄曲霉侵染等具有重要的屏障作用。

花生种皮结构是评价花生种质抗、感黄曲霉侵染能力的重要指标，普通显微观察表明：抗病品种的种皮结构存在较大差异，抗病品种的种皮细胞壁较厚，表皮细胞间结合紧密，栅栏细胞层严密厚实，裂缝和气孔较少；感病品种的种皮细胞壁则相对较薄，细胞间结合较疏松，裂缝和气孔较大，种皮具有较厚蜡质层。但是由于花生籽仁油分和蛋白质含量高，制作普通切片时，存在粘刀、薄厚不均、不连续或不完整等问题，很难得到理想的切片。

石蜡切片法由于操作简单、价格低廉、可连续制片等特点，一直是观察细胞组织的形态结构及其动态变化的理想生物学研究技术。石蜡切片制作过程包括：固定、脱水、透明、透蜡、包埋、切片、贴片、脱蜡、染色、透明以及封片等步骤，在生物学的许多领域都得到了广泛的应用。但是由于花生籽仁油分和蛋白质含量非常高，其石蜡切片的效果一直不尽人意。

因此为便于观察花生细胞组织结构及动态变化，深入分析黄曲霉侵染花生的细胞学机理，明确抗、感黄曲霉花生种质的细胞学差异，筛选抗黄曲霉花生种质用于生产实践，亟需一种可获得理想切片的花生籽仁的石蜡切片方法，但是目前关于这类该切片方法尚未见报道。

【发明内容】

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种花生籽仁的石蜡切片方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种花生籽仁的石蜡切片方法，包括以下步骤：

1）取材；

2）固定：采用体积浓度为5%~10%戊二醛固定；

3）脱水：80%乙醇50min，95%乙醇45min，100%乙醇45min，每梯度至少2次脱水过程；

4）透明：体积比1:1二甲苯:100%乙醇处理20~30min，二甲苯处理15~25min，二甲苯处理15~25min；

5）透蜡、包埋和切片：采用熔点为54~56℃的切片石蜡的直接透蜡2次，每次1.5~2h，透蜡后包埋，切片；

6）脱蜡、染色和封片：

脱蜡：二甲苯30~40min，重复1次；

复水：100%乙醇2~3min，重复1次；95%乙醇2~3min，重复1次；80%乙醇2~3min，重复1次；50%乙醇2~3min；蒸馏水2~3min；

复染：苏木素染液6~8min，蒸馏水冲洗5~7min，曙红染液染色3min15s~4min；

脱水：95%乙醇2~3min，重复1次，100%乙醇2~3min，重复1次；

透明：二甲苯2~3min，重复3次；

封片。

优选的，所述的花生籽仁的石蜡切片方法包括以下步骤：

1）取材；

2）固定：采用体积浓度为5%戊二醛固定；

3）脱水：80%乙醇50min，95%乙醇45min，100%乙醇45min，每梯度至少2次脱水过程；

4）透明：体积比1:1二甲苯:100%乙醇处理20min，二甲苯处理15min，二甲苯处理15min；

5）透蜡、包埋和切片：采用熔点为54~56℃的切片石蜡直接透蜡2次，每次1.5h，透蜡后包埋，切片；

6）脱蜡、染色和封片：

脱蜡：二甲苯30min，重复1次；

复水：100%乙醇2min，重复1次；95%乙醇2min，重复1次；80%乙醇2min，重复1次；50%乙醇2min；蒸馏水2min；

复染：苏木素染液6min，蒸馏水冲洗5min，曙红染液染色3min15s；

脱水：95%乙醇2min，重复1次，100%乙醇2min，重复1次；

透明：二甲苯2min，重复3次；

封片。

所述的苏木素染液为每升蒸馏水中含有苏木素1g、碘酸钠0.2g、钾明矾90g、柠檬酸1g、水合氯醛50g。

所述的曙红染液由以下物质组成：质量分数为1%的曙红Y水溶液、95%乙醇和冰醋酸，其体积比依次为100:780:4。

本发明的改进之处具体如下：