[发明专利]新的β-肌动蛋白和RPS21 启动子及其应用

说明书

本申请是申请日为2004年06月24日、申请号为201010145615.5、发明名称为“新的β-肌动蛋白和RPS21启动子及其应用”的发明申请的分案申请。 

本发明要求2003年6月24日提交的美国临时申请No.60/480,768的优先权，该申请引作参考而并入此文。 

技术领域

本发明涉及调节基因元件，如启动子及其应用，例如，在表达蛋白中的应用。更特别地，本发明涉及β-肌动蛋白和核糖体蛋白S21基因的启动子。 

技术背景

每种真核基因含有驱动该基因转录的调节元件。该调节元件包括典型地直接位于该基因编码区上游的启动子。作为转录机制的一部分，启动子通过提供转录因子的结合位点来调节转录。启动子通常被用于在细胞培养中和体内表达蛋白质。很多启动子是已知的并被用于各种表达系统中表达蛋白质。启动子的例子包括巨细胞病毒（CMV）立即早期启动子、劳氏肉瘤病毒基因组大基因组长末端重复（RSV）、猿病毒40（SV40）启动子、干扰素基因启动子、金属硫因启动子、和胸腺嘧啶激酶启动子及其它，如Fernandez等人（1999）在Gene Expression System，Academic Press中所描述的。然而，在本领仍需要提供一种可以产生高表达水平和/或在长时间内维持表达的启动子。 

β-肌动蛋白是一种结构蛋白，其通常在从原核到真核，包括人的所有物种中表达。先前描述了人和鸡的β-肌动蛋白启动子。一般而言，β-肌动蛋白启动子表现出比广泛被应用的CMV启动子更普遍的活性（Xu等（2001）Gene 272：149-156）。仅仅当其被连接到CMV增强子 序列时，鸡的β-肌动蛋白启动子比病毒CMV和SV40启动子具有更高的活性（Xu等，supra）。 

核糖体蛋白S21（rpS21）与核糖体40S亚单位有关。人的rpS21基因的启动子已被鉴别（ 接收号No.AJ250907）。与大多数核糖体启动子基因相似，其缺少传统的转录元件，如TATA盒和CAAT序列（Smirnova等（2000）Bioorg.Khim.26(5):392-396）。 

发明内容

本发明提供了一种新的β-肌动蛋白启动子，其与前述公知的β-肌动蛋白启动子相比具有低水平的序列同源性（如，人或鸡）。本发明还提供了新的rpS21启动子，其与前述公知的rpS21启动子相比具有低水平的序列同源性（如，人或小鼠）。 

本发明部分基于对中国仓鼠卵巢细胞（CHO）系来源的β-肌动蛋白和rpS21启动子的发现和分离。本发明进一步部分基于仓鼠β-肌动蛋白启动子比CMV启动子具有显著的高活性的观察。本发明进一步部分基于当被用于表达一定基因时，rpS21启动子至少具有与仓鼠β-肌动蛋白启动子相同的活性的观察。本发明提供了这些启动子的核酸序列，并包括具有启动子活性的各种核酸序列的变种。在一些实施例中，本发明的β-肌动蛋白启动子来源于啮齿类，如仓鼠、大鼠和小鼠。典型地rpS21启动子来源于仓鼠。 

本发明进一步提供了含有可操作地连接到异源核酸上的本发明的β-肌动蛋白或rpS21启动子的载体。在某些实施例中，本发明的载体包括可操作地连接到异源核酸上的启动子，该异源核酸编码异源表达产物，如治疗蛋白质或其片段。在示例性实施例中，表达产物是酸性鞘磷脂酶(ASM)、α-葡萄糖苷酶（GAA）、或组织血浆酶原激活剂（tPA）。 

本发明还提供了用本发明的载体转染的宿主细胞。在描述性实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞，如CHO、HEK和BHK。 

本发明还提供了用于产生蛋白质的方法。产生蛋白质的方法包括，例如，培养转染细胞，该细胞用含有可操作地连接到编码蛋白质的异源核酸上的本发明的β-肌动蛋白启动子和/或rpS21启动子的载体转染的细胞，以及回收蛋白质。在一些实施例中，异源表达产物是分泌 蛋白，其从培养基中被回收。在描述性实施例中，蛋白质是ASM、GAA、或tPA。 

本发明还涉及： 

1.一种选自SEQ ID NOs：1、2、3的核苷酸序列的分离的啮齿动物β-肌动蛋白启动子或其具有启动子活性的变种。 

2.一种SEQ ID NO：1中列出的分离的仓鼠β-肌动蛋白启动子核苷酸序列，或其具有启动子活性的变种。 

3.一种SEQ ID NO：2中列出的分离的大鼠β-肌动蛋白启动子核苷酸序列，或其具有启动子活性的变种。