[发明专利]一种蜂毒肽反序类似物及其制备方法

权利要求书

1.一种蜂毒肽反序类似物，其特征在于，所述蜂毒肽反序类似物的氨基酸序列为RKRKRWSILAPLG。

2. 根据权利要求1所述蜂毒肽反序类似物，其特征在于，所述蜂毒肽反序类似物为采用固相化学合成技术合成的多肽产品。  

3. 一种蜂毒肽反序类似物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括以下步骤：

（1）将存放于冰箱中的原料试剂取出，置于干燥器中复温待用；

（2）精确称量Fmoc-AA-Resin 0.1mmol后，置于合成反应器中，用DMF冲洗六次，然后加入约Fmoc-AA-Resin体积2～3倍量的DMF浸泡30分钟，通入氮气使Fmoc-AA-Resin能在溶液中上下翻动；

（3）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应10分钟，然后用DMF冲洗两次；

（4）再次加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20% 哌啶于合成反应器中，通入氮气反应20分钟，然后用DMF冲洗六次；

（5）称量0.45mmol的Fmoc-AA、HOBt和HBTU，先用1ml DMF溶解HOBT及HBTU，后将溶液加入Fmoc-AA中，活化15分钟；

（6）将活化好的Fmoc-AA溶液以及1mL DIEPA同时加入Fmoc-AA-Resin中；

（7）调节氮气的流量，使Resin能在溶液中上下翻动，使反应更完全，反应时间一般为2小时；

（8）反应结束后用DMF、DCM、DMF依次各洗Fmoc-AA-Resin 两次；

（9）重复步骤（3）至步骤（8），直到多肽序列偶联完为止；

（10）加入2倍Fmoc-AA-Resin体积的20%哌啶反应，连续操作两次，反应时间分别为10分钟和20分钟，分别用DCM、DMF、DCM依次各洗Resin 两次，最后一次洗完后，将Resin尽量抽干，即得肽树脂；

（11）配制裂解液：1g肽树脂对应10ml裂解液；

（12）将裂解液加入到合成反应器中，通入氮气反应2小时，期间需不时补充裂解液以防蒸干，另将无水乙醚置于-20℃冰箱中冷冻备用；

（13）反应完成后，将裂解液收集到预先称重的50ml离心管中，再用TFA清洗合成反应器2-3次，洗液同样收集到50ml离心管中；

（14）将冰箱中的无水乙醚取出，选择合适的容器将乙醚倒入其中，按无水乙醚 ：裂解液＝10 ：1的体积比例将裂解液滴入冰冻的无水乙醚中，控制速度，尽量使滤液逐滴滴入，同时不断搅拌至不再产生沉淀为止；

（15）将沉淀混合物静置数分钟后离心，弃上清，然后用新鲜的冰冻无水乙醚洗涤沉淀至少三次；

（16）将所得沉淀物风干，之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥并称重；

（17） NH₄HCO₃ 自然氧化法氧化粗肽：配置0.1M NH₄HCO₃溶液，按多肽终浓度0.3mg/ml 的比例加入NH₄HCO₃溶液至粗肽中，室温搅拌过夜；之后用封口膜封口，扎密孔，用冻干机冷冻真空干燥；

（18）将氧化后的粗肽进行纯化并质谱分析鉴定，并得到蜂毒肽反序类似物；

（19）将纯化并经质谱分析鉴定合格的蜂毒肽反序类似物用冻干机冷冻真空干燥，称重备用。