[发明专利]一种检测乳腺癌的microRNA标志物集及在试剂盒中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术诊断领域，尤其涉及一类用于检测乳腺癌的microRNA标志物及应用。

背景技术

microRNA是一类长度约为20-24nt的具有调控功能的非编码RNA。其主要参与基因转录后水平的调控。

microRNA具有以下特点：①细胞特异性：不同组织不同细胞microRNA的表达谱特征不同；②“时空”特异性：细胞在不同发育阶段，microRNA组成不同；③保守性：不同种属、不同组织器官以及不同细胞之间相同的microRNA分子具有相似的调控功能；④稳定性高：microRNA在PH改变，DNA以及RNA裂解酶的作用下，不易降解，具有很高的稳定性。因此microRNA是天然的优秀生物标志物，已有报道不同microRNA被实验室确认为一些恶性疾病的分子标志物。

2010年2月，血浆（或血清）miR-92被成功用作结直肠癌的分子标志物，灵敏度可达89%，特异性达到70%，且肿瘤切除后miR-92的表达量较术前显著降低。血清miR-92作为分子标志物可以诊断Ⅰ～Ⅳ期的结直肠癌，早期诊断可以大大提高生存率和改善预后效果。在舌鳞状上皮细胞癌的研究中发现，miR-184在癌组织中的表达提高了59倍以上，患者术后的血浆（或血清）miR-184表达量降低到只有原来的1/10，这表明血浆（或血清）中microRNA表达谱的变化与肿瘤组织关系密切，血浆（或血清）microRNA表达谱有可能替代组织microRNA表达谱作为肿瘤标志物。

虽然疾病组织microRNA表达谱往往与疾病发病及预后密切相关，但是检测技术复杂、创伤大，难以真正应用于临床诊断，且不同的microRNA对不同疾病的诊断特异性差异较大。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种用于检测乳腺癌的microRNA标志物集，通过microRNA的3’尾部添加PolyA尾，通过反转录PCR及荧光定量PCR的方法特异性的来检测被测者血清或血浆中该microRNA的含量，并与正常microRNA水平比较来诊断乳腺癌，这类microRNA特异性和灵敏度高。

本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种检测乳腺癌的microRNA标志物集，所述microRNA标志物集的序列为SEQ ID NO：n所示microRNA或与所述SEQ ID NO：n所示序列互补的microRNA，其中n为1至4的正整数。所述microRNA标志物集中的1至4的每条microRNA标号分别为miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b，其序列分别为其序列为5’-ACCGT TACCATTACT-3’（SEQ ID NO：1），5’-GGGTCAGTGCACT-3’（SEQ ID NO：2），5’-TCACAGTGGCTAAGT-3’（SEQ ID NO：3），5’-GTAAACAT CCTACAC-3’（SEQ ID NO：4）。

上述标号分别为miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b的4条microRNA标志物通过谱系筛查的方式，即通过以下步骤得到：

第一步：从公开发表的资料中，查找、搜集与乳腺癌相关小分子RNA（microRNA）乳腺癌标志物，共计755条，其中，包括了世界不同人种。

第二步：选择样本：选择临床确诊的、未用药物治疗的患者4人，每人术前、术后（7天）各采集血清0.5ML/份以上。放置-80度冰柜备用。并采集临床确诊乳腺癌阴性对照血清1份，血清量在0.5ML以上。

第三步：谱系筛查：用以上9份血清（术前4人份、术后4人份、1份对照），同时检测750条选择的小分子RNA标志物，通过高通量分析，筛选与对照人群反向分离的标志物，第一次谱系筛选，选择出特异组，85条；在用以上相同检测分析方法，第2次谱系筛查出16条，第3次筛查相对特异性高的4条，这4条小分子RNA被迈誉森生物科技有限公司确定为对中国人有较高特异性的“microRNA乳腺癌肿瘤标志物”。

第四步：验证用谱系筛查出的标号分别为miR-451，miR-148a，miR-27a，miR-30b的4条乳腺癌肿瘤标志物。

本发明的有益效果是：筛查出的microRNA标志物集作为用于检测乳腺癌的特异性和灵敏度高。

在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。

本发明还包括权利要求1所述的一种检测乳腺癌的microRNA标志物集在制备乳腺癌的诊断试剂中的用途。