[发明专利]埃塞俄比亚芥脂肪酸延长酶及其编码基因

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学和基因工程领域，更具体地，涉及埃塞俄比亚芥(Brassica carinata A.Braun)脂肪酸延长酶(FAE1)及其编码基因。

背景技术

芥酸(erucic acid，C22:1)是一种超长链不饱和脂肪酸，主要存在于十字花科(Brassicaceae)和金莲花科(Tropaeolaceae)植物种子中。作为植物的代谢产物，芥酸还在一定程度上影响植物的生长发育，在植物与环境的相互作用中，参与了生物膜角质或蜡质的合成。从营养价值来说，芥酸是食用油的抗营养成分，不易被人体消化吸收，容易导致冠心病和脂肪肝等病害发生。然而，在工业上，芥酸及其衍生物芥酸酰胺等具有较好的增塑性和疏水性，因此具有广泛的用途，是生产润滑剂、防腐剂、化纤原料和化妆品等化工产品的重要原料。

FAE1(Fatty Acid Elongase 1)基因是调控芥酸合成的关键基因，虽然自James等最先从拟南芥中克隆到FAE1基因以来，陆续有完整的FAE1基因从各种十字花科植物中被分离出来，但目前对于FAE1基因的克隆仅局限于拟南芥及芸苔属少数几种植物中，而十字花科是芥酸分布的主要种质资源，植物种类多，芥酸含量复杂，是FAE1基因克隆的合适材料。

本发明通过BcFAE1基因的真核表达，获得活性蛋白，同时脂肪酸含量检测分析发现该基因所编码的蛋白对芥酸合成有催化活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种来自于芥酸含量较高的埃塞俄比亚芥中的脂肪酸延长酶(Fatty Acid Elongase 1，FAE1)及其编码基因。

本发明的埃塞俄比亚芥的FAE1基因由1251个碱基组成，含有一个完整的开放阅读框，为序列表中的1号序列，将此基因命名为BcFAE1。

本发明的埃塞俄比亚芥FAE1蛋白由506个氨基酸组成，开放阅读框的起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。BcFAE1蛋白的理论分子量为56.37kDa，等电点为9.54。

含有上述序列1及其开放阅读框架的多核苷酸的载体，以及用上述序列1及其开放阅读框架的多核苷酸转化的生物细胞，均是本发明需要保护的内容。

本发明基因的发现，使通过转基因来调控芥酸合成成为可能，对于培育高芥酸的转基因十字花科作物具有重要意义。

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。

附图说明

图1为埃塞俄比亚芥基因组DNA

图2为BcFAE1基因全长PCR扩增产物

图3为真核表达载体pYES-BcFAE1的构建流程图

图4为载体pYES-BcFAE1的酶切图谱

图5为酵母中BcFAE1表达产物的Western Blot分析

具体实施方式

实施例1、基因BcFAE1的克隆

克隆BcFAE1，具体步骤如下：

一、BcFAE1基因的获得

埃塞俄比亚芥在正常条件下栽培，待真叶长出，采集叶片，从叶片中提取DNA，进行聚合酶链式反应，最终获得BcFAE1基因。

1、埃塞俄比亚芥基因组DNA的提取

取新鲜幼嫩的活体植物叶片约0.2g，在液氮冷冻条件下充分研磨，转入1.5mL的离心管中，加入500μLCTAB提取液，65℃水浴45min，期间颠倒混匀3次；加入500μL体积比为24∶1的氯仿-异戊醇，混合均匀，12000r·min^-1离心15min；取上清，加2倍体积无水乙醇，-20℃冰箱中过夜；4000r·min^-1离心15min使DNA沉淀；700μL70％乙醇清洗2次，4000r·min^-1离心10min，再用700μL无水乙醇清洗1次，4000r·min^-1离心10min，得DNA沉淀晾干；最后加100μL去离子水使沉淀溶解。电泳检测结果如图1所示。

2、聚合酶链式反应PCR

以上述得到的埃塞俄比亚芥基因组DNA为模版，以分别带有KpnI与BamHI酶切位点的TFK(5′CGGGGTACCGCAATGACGTCCGTTAAC 3′)与TRB(5′CGCGGATCCGGACCGACCGTTTTGGAC 3′)为引物，按以下反应扩增出BcFAE1基因。反应体系如下：