[发明专利]用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统及分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于蛋白分离的多维液相色谱分离系统，具体地，涉及一种用于蛋白在线快速分离的多维液相色谱分离系统。本发明还涉及使用该液相色谱分离系统进行蛋白分离的分离方法。

背景技术

液相色谱是分析、分离和纯化蛋白最有效的方法，其广泛应用于从天然的动植物体液提取和分离活性蛋白，及基因工程生产的各种重组蛋白药物的制备和生产，也是生化实验室必不可缺的设备，如在蛋白组学研究中为寻找“标记”蛋白的蛋白及多肽分离。由于这样的生物大分子所存在的环境成分十分复杂，通常称之为复杂成分中的生物大分子的分离和分析。色谱柱是色谱分析的核心。科学家一直在尽力提高色谱柱效以用一根色谱柱就能解决一般较复杂的物质分离和分析问题。对分离小分子溶质而言，液相色谱柱的理论塔板数一般为10⁴-10⁵。然而，对于更复杂混合物的分析，比如细胞中的成份、体液及动物组织中成分的分离，目前商品色谱柱的分离度远远达不到要求，因此必须要用二维液相色谱法（2D-LC）或多维液相色谱法（mD-LC）才能部分地解决这些问题。2D-LC和mD-LC技术已经成为当前色谱研究的热点和未来发展的方向。

进行2D-LC和mD-LC分离有离线（off-line）和在线（on-line）两种方式。

早期的2D-LC分离法主要是离线的方式，就是将一维液相分离后的馏分收集后对该一维馏分，或不经过处理直接进一少部分样，或须进行处理（浓集或缓冲液交换）后，再将其一部分，或全部进样到第二维色谱柱进行分离。离线方式具有费时、难于操作、样品易污染、回收率低和重复性差等缺点。

为适应2D-LC和mD-LC法的研究，多个公司都开始开发在线模式的2D-LC和mD-LC法，很快就生产了这种类型的色谱仪。但原则上这些色谱仪都是在已有色谱仪的基础上加以改进，增加了一组并联的色谱柱（2-3根），且在这些并联色谱柱之间加上切换接口，以使从一根色谱柱流出的馏分能在线地转到另一个柱以进行下一个模式分离。然而，这些在线2D-LC和mD-LC法存在着诸多问题，例如不同模式的色谱的组合需要解决流动相兼容性的问题，接口衔接也是很关键的技术问题。

mD-LC技术中的切换接口是整个系统的关键。常用的有样品环交替储存转移样品、平行柱交替富集分析样品和捕集柱富集样品以及无接口的整体两根色谱柱。然而这些仪器均存在致命的缺陷。有接口的在线2D-LC和mD-LC用液相色谱仪均只能将一维收集的样品的1-10%进样（仅限几微升）到第二维色谱分离，无法用其于蛋白质制备，尤其是无法实施工业化生产；而无接口的这种混合模式柱的两种流动相必须兼容，只能在一些特定情况下，如强阳离子交换色谱（SCX）填料在前，反相液相色谱（RPLC）填料在后的情况下方可实现如此的在线二维分离，如果二者填充顺序相反，则该无切换器法就无法使用。

在此科学发展的背景下，科学家又提出了“混合模式色谱”（mixed-modechromatography，MMC）法，即在液相色谱中同时应用两种或两种以上的作用力使溶质进行保留和分离的色谱方法。该方法具有更高的选择性和高色谱柱负载量，这为半制备和制备型色谱的发展提供了新的选择和思路。然而，与传统的色谱柱只能用于由一种力控制的一种分离模式比较，因其还是以一种作用力为主，而另外一种作用力为辅，从而达到改善该主分离里的效果，故也只能达到“一柱一用”的效果。